一、實驗目的
學習和掌握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法。
二、實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標準方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖,具親水性,但不帶電荷,是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下(pH8.0的緩沖液)帶負電荷,在電場中通過凝膠介質向正極移動,不同DNA分子片段由于分子和構型不同,在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡合物,經紫外線照射后,可分出不同的區帶,達到分離、鑒定分子量,篩選重組子的目的。上海創賽科技提供1239-45-8,溴化乙錠(EB),BR 進分99%,商品編號:D16-1013683-1g,價格518元。
三、實驗材料
實驗14提取的DNA樣品,
四、器具及藥品
電泳儀,電泳槽,紫外透射反射儀,恒溫水浴鍋,微波爐,微量進樣器,三羥甲基氨基甲烷,鹽酸,醋酸鈉,EDTA,瓊脂糖,溴酚藍,溴化乙錠。上海創賽科技提供77-86-1,三羥甲基氨基甲烷,Tris>99%,分子生物學級 ,商品編號:C84-3739-100g,價格65元。
五、實驗步驟
1、安裝電泳槽
將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈,晾干,用膠帶將兩端的開口封好,放在水平的工作臺上,插上樣品梳。
2、瓊脂糖凝膠的制備
稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中,(按0.3-1.5%的瓊脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝膠,20-100kb的DNA用0.5%的凝膠,200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠)置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化(不要加熱至沸騰),取出搖勻。上海創賽科技提供9012-36-6,瓊脂糖 ITM,Agarose ITM,Gel Strength(1.5% gel)>1,200 g/cm2 ,商品編號:C84-2678-5G,價格93元。
3、灌膠
將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4、待瓊脂糖膠凝固后,在電泳槽內加入電泳緩沖液,然后拔出梳子。
5、加樣
將DNA樣品與加樣緩沖液按4:1混勻后,用微量移液器將混合液加到樣品槽中,每槽加10-20μl,記錄樣品的點樣次序和加樣量。
6、電泳
安裝好電極導線,點樣孔一端接負極,另一端接正極,打開電源,調電壓至3-5V/cm,電泳1-3hr,當溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時,停止電泳。上海創賽科技提供JY-JX5快速SSR電泳槽,電泳儀,商品編號:C71-JY-JX5-臺,價格1176元。
7、染色和觀察
取出凝膠,放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外燈下觀察,有橙紅色熒光條帶的位置,即為DNA條帶,或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑,操作時要小心,必須戴手套。上海創賽科技提供UV-Ⅱ手提紫外燈,紫外分析儀,商品編號:C71-UV-Ⅱ-臺,價格1050元。
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