【試劑】
1、蘇丹黑染色液
將蘇丹黑B加到無水乙醇中至飽和,搖蕩使乙?;?。用前過濾。上海創賽科技提供4197-25-5,蘇丹黑B,GR ,商品編號:D16-1032969-100G,價格431元。
2、巴比妥緩沖液
稱取巴比妥鈉15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后再加蒸餾水至1000mL(pH為8.6,離子強度0.075),為電極緩沖液。上海創賽科技提供巴比妥酸,Barbituric acid,99.5%,用于糠醛衍生物的比色分析及氰化物測定,67-52-7 ,商品編號:C16-B10490-25g,價格290元。
3、凝膠緩沖液
取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g,用蒸餾水溶解后,稀釋至1000mL,pH為8.6。上海創賽科技提供77-86-1,三羥甲基氨基甲烷,Tris>99%,分子生物學級,商品編號:C84-3739-100g,價格65元。
4、瓊脂糖凝膠
稱取瓊脂糖0.45 g溶于50 mL凝膠緩沖液中,再加水50 mL。在水浴中加熱至沸,待瓊脂糖完全溶解后,立即停止加熱。
【操作】
1、預染血清
血清0.2mL中加蘇丹黑染色液0.2mL,混合置37℃水浴中染色30分鐘,離心(2000轉/分)約5分鐘。以除去懸浮于血清中染料沉渣。
2、制備瓊脂糖凝膠板
將已配制好的0.5%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化,用吸管吸取凝膠溶液澆注在載玻片上,約3 mL。靜置半小時后凝固(天熱時需延長,也可放入冰箱中數分鐘以加速凝固)。
3、點樣
將剪好的濾紙條對折,以折邊在距凝膠一端2cm處切一點樣口。將毛細管插入預染好的血清中,待吸入部分血清后,取毛細管使其有樣品的一端靠于點樣口端部,???秒左右。
4、電泳
將凝膠板平放入電泳槽中,使加樣端接在陰極一側,用四層濾紙或紗布做成“引橋”,敷于膠板的兩端,各搭住凝膠板約1cm左右,“引橋”的另一端浸于電泳槽內的巴比妥緩沖液中。接通電源,首先調節電流為3-4mA/凝膠板,電泳10-15分鐘;然后調節電流為6-7mA/凝膠板,電泳30-40分鐘,即可觀察到分離的區帶。
5、保留電泳圖譜
可將電泳后的凝膠板(連同載玻片)放入清水中浸泡脫鹽2小時,然后放烘箱(80℃左右)中烘干即可。
【注意事項】
1、電泳樣品應為新鮮的空腹血清。
2、加熱溶化瓊脂時,須防止水份蒸發過多。瓊脂糖凝膠最好隨用隨制,以免凝膠表面干燥,影響分離效果。
3、制作凝膠板時瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜,高于1%以上α-脂蛋白部分較緊密,β和前β-脂蛋白部分不夠清晰;低于4.5%則凝固性較差,圖譜不清。
4、點樣口要大小適宜,邊緣整齊、光滑,否則會影響電泳圖譜。
5、在α-脂蛋白前若出現較淺區帶,可列為前α-脂蛋白。
【正常參考范圍】
α-脂蛋白 20~30%
β-脂蛋白 20~30%
前β-脂蛋白 0~28%
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