PART 1 CCK-8 簡介
■ CCK-8 比色檢測試劑盒
Cell Counting Kit-8，是一種基于 WST-8 而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細胞樣品中，不需要預配各種成分。WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶的電子傳遞還原生成橙黃色的甲瓚(Formazan)。而線粒體脫氫酶只在活細胞中存在，因此細胞增殖越多越快，則顏色越深；化合物的細胞毒性越大，細胞死亡量越多，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺(生成的甲瓚量) 和細胞數目呈線性關系?？赏ㄟ^酶標儀檢測 430-490 nm 處的吸光度 (OD 值)，OD 值與細胞活力成正比，從而進行定量分析。
圖 1. CCK-8 檢測原理
圖 2. 不同的細胞活力檢測方法的優缺點
MCE CCK-8 產品一經推出，就受到了大家的信賴和一致好評，其助力發表的文章數量也在逐年增加。小 M 對發表文章的影響因子進行分析發現，CCK-8 助力發文期刊的影響因子分布較廣，IF≥10 的共有 170+ 篇，5≤IF≤10 的共有 560+ 篇。
圖 3. 左：MCE CCK-8 助力發表文章數年增長情況
右：不同影響因子文章數分布情況
(截止至 2022 年 9 月)
■ 高分文獻驗證
其中最高分文章為中國科學院上海營養與健康研究所肖意傳教授團隊的 Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation，發表在 Immunity (IF 43.474)。
其他高分期刊還包括
Mol Cancer (IF 41.444)；
Signal Transduct Target Ther (IF 38.104) ;
Adv Mater (IF 32.086) 等。
更多文章可下滑點擊
Cell Mol Immunol. 2022 Sep;19(9):1030-1041.
J Med Virol. 2022 Aug;94(8):3847-3856.
ACS Nano. 2022 Aug 3. 10.1021/acsnano.2c06300. Nat Commun. 2022 May 10;13(1):2563.
Immunity. 2021 Apr 13;54(4):632-647.e9. Adv Mater. 2021 Nov;33(45):e2104594. Nat Cell Biol. 2020 Dec;22(12):1447-1459. Signal Transduct Target Ther. 2020 Nov 6;5(1):216. Mol Cancer. 2019 Nov 14;18(1):161.
PART 2 CCK-8 的應用與案例
■ 客戶驗證 1---細胞毒性實驗
為了驗證篩選的 iZAK2 對衰老相關自身免疫的治療作用，在小鼠原代 CD4+T 細胞中檢測了 iZAK2 的生物學功能，結果發現 iZAK2 處理不影響細胞活力或細胞質 DNA 積累。此外，iZAK2 可減輕老齡小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE) 相關自身免疫癥狀，以上結果都表明 iZAK2 是一種潛在的治療衰老相關自身免疫性疾病的化合物。
圖 4. iZAK2 對小鼠原代 CD4+T 細胞活力的影響[1]
■ 客戶驗證 2---細胞活力檢測
為了驗證 poly (I:C) 預處理在體外抑制炎癥反應和凋亡細胞死亡，用 CCK-8 法檢測 H9C2 細胞中不同復氧時間和不同 poly (I:C) 濃度下的細胞活力，結果表明 poly (I:C) 預處理顯著抑制了糖氧剝奪 (OGD) 誘導的炎癥和凋亡反應來限制細胞死亡。
圖 5. CCK-8 法測定不同復氧時間和
不同 poly (I:C) 濃度下的細胞活力[2]
■ 客戶驗證 3---細胞增殖測定
吞噬死亡細胞對于維持組織內穩態和預防炎癥是必不可少的，經典理論認為這一過程主要是由巨噬細胞和樹突狀細胞等專職性吞噬細胞完成的。然而，越來越多的數據表明鄰近的非專職性細胞在這一過程中也發揮了作用。雖然吞噬的死細胞可以為活細胞提供營養，但實驗結果表明吞噬和沒有吞噬死細胞的細胞在增殖方面并沒有很顯著的差異。
圖 6. CCK-8 法測定 NIH 3T3 細胞
吞噬死細胞前后的細胞活力[3]
PART 3 CCK-8 使用注意小貼士
小白: CCK-8 與細胞孵育后一般多久可以檢測呢？
小M: CCK-8 的培養時間一般為 1-4 h，但在培養 30 min 左右即可肉眼觀察顯色程度，最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。
小白: CCK-8 檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑會干擾檢測，那我該如何確定我的待測溶液是否有還原性呢？
小M: 將不含細胞的待測溶液孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，孵育 1-4 h 后，測定在 450 nm 處的空白吸光度。若測得的吸光度很小，則說明含有較少的還原劑，正式實驗可以直接加入 CCK-8 進行檢測；若測得的吸光度相對較大，則說明存在較多還原劑，正式實驗時需去除培養基，將細胞洗滌兩次后，再加入新的培養基和 10 μL CCK-8 溶液。
小白: 那培養基中含有酚紅會對最終的實驗結果有影響嗎？
小M: 培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
小白:CCK-8 和活細胞內的脫氫酶持續反應使溶液顏色不斷加深，我該如何終止 CCK-8 反應呢？
小M: 以下方法任選其一均可終止 CCK-8 反應：a). 在顯色反應后，將培養板放置 4℃ 冰箱內；b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液；c). 每孔加 10 μL 1% (w) 的 SDS 溶液。
小M: 此外，需要注意！若培養時間較長，一定要注意蒸發問題?？梢栽?96 孔板的四周每孔中加入培養基或無菌 PBS，同時將培養板置于靠近培養箱內水源的地方，緩減蒸發。
小白：Get Get 新技能GET
參考文獻
1. Wang Y, et al. Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation. Immunity. 2021 Apr 13;54(4):632-647.e9.
2. Chen E, et al. Poly(I:C) preconditioning protects the heart against myocardial ischemia/reperfusion injury through TLR3/PI3K/Akt-dependent pathway. Signal Transduct Target Ther. 2020 Nov 6;5(1):216.
3. Lu J, et al. Efficient engulfment of necroptotic and pyroptotic cells by nonprofessional and professional phagocytes. Cell Discov. 2019 Aug 6;5:39.
