CY 為花菁 (Cyanine) 的縮寫，經典的菁染料含有兩個含氮雜環，分子內部含有由甲川基 (CH)n 組成的共軛鏈，n 可為奇數或偶數。吸光度和熒光波長可通過選擇聚次甲基橋的長度來控制：越長的花菁素具有較高的吸光度和發射波長 (圖 1 所示)。根據鏈中的碳原子數，菁類由甲川基被分為一甲基 (CY1，n=0)、三甲基 (CY3，n=1)、五甲基 (CY5，n=2) 和七甲基 (CY7，n=3)。
圖 1. 經典花菁素結構及發射光譜示意圖
CY 染料的分類
CY 染料分為非磺化花菁和磺化花菁。兩者的光譜特性基本相同，在 DNA 和蛋白質的標記中，它們是可互換的，兩種均可用于標記生物分子?；腔ㄝ既玖暇唧w水溶性，且不易在水中聚集，是抗體和蛋白標記的選擇。
圖 2. 共聚焦顯微鏡觀察患者腎、肝和腫瘤的組織切片中 Cy5 的攝取情況[3]
文中所用 Cy5來自 MCE
CY 活化基團的選擇
根據需要標記的生物分子的可標記基團 (胺基、醛基或巰基) 以及酸堿性，選擇相應的活化染料和反應條件。為減少空間位阻影響，CY 染料常做各種修飾，具體如下：1) Succinimidyl ester (SE) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白的氨基末端或伯胺反應，從而實現包括多肽、抗體等的蛋白標記。標記反應相對于游離酸形式，空間位阻更小，反應更加穩定，有效；如 Shiqi Huang 等人研制出一種經過修飾的納米載體，用于治療因黑色素瘤導致的肺部腫瘤，研究人員用Cy5-SE 標記了四種修飾的納米顆粒導入小鼠體內，并觀察肺部熒光圖像，進而確定納米顆粒的聚集情況。結果表明，小鼠的肺部有大量的 Cy5-SE 標記的納米顆粒靶向聚集，延緩了腫瘤的生長，該文章用熒光標記的方法證明了納米載體抗腫瘤活性實驗的可靠性。
圖3. CY5-SE 標記四種修飾載體蛋白的熒光圖像[2]
2) Hydrazide (酰肼) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的醛基反應，多用于神經元細胞的電極失蹤和神經縫隙連接硏究；該類型 CY 染料還可用于糖基化抗體的標記；如 J.E.Noble 等用 Hydrazide 修飾的 CY3對四種糖基化抗體進行偶聯 (半乳糖、唾液酸、N 乙酰氨基葡萄糖和甘露糖)，得到穩定的 CY3-Hydrazide 標記抗體。3) Maleimide (馬米酰亞胺) 修飾：該類型 CY 染料可與蛋白等生物分子的巰基反應，實現有效標記。
CY 花菁類染料優點
1) 光譜窄，信號強；
2) 花菁類染料的摩爾吸光系數高于其他熒光染料；3) 磺化花菁類染料易溶于水，對組織細胞毒性小，適用于動物和細胞實驗；
4) 熒光波段在近紅外區段的組織透過性更好。
標記反應操作
以 NHS 活化脂 CY 標記蛋白為例，如下圖所示：
圖 3. CY 標記蛋白操作流程將蛋白溶液與配置好的染料工作液倒入反應溶劑中 → 用移液器上下輕打混勻→ 常溫下靜置或輕微混動反應 3-5 個小時 (可過夜)→ 反應結束后進行透析除去未標記染料→ 避光放置在 4°C 保存
| ProductName | λex/λem | Description |
488/520 | 是一種花青染料，可標記多肽，蛋白和寡核苷酸種的氨基。 | |
| Cy2-SE (iodine) | 488/520 | Cy2-SE (iodine) 為 Cy2 的 SE 修飾所得，可標記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 |
555/580 | Cy3 (Cyanine 3) 是一種發橘黃色熒光的花青素熒光染料?？梢杂?530nm-561nm 的激光束激發后用 TRITC 的濾片觀察。 | |
555/580 | Cy3-N3 是 Cy3 疊氮化物熒光染料，用于多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 | |
555/580 | CY3-YNE (Sulfo-Cyanine3-alkyne) 是一種染料，可用于標記可溶性蛋白、肽和寡核苷酸/ DNA。 | |
659/670 | Cy5 是明亮的紅色熒光染料，用于標記肽，蛋白質，寡核苷酸的氨基基團的反應染料。 | |
659/670 | Cy5-SE (Cy5 NHS Ester) 是一種用于標記肽，蛋白質，寡核苷酸的氨基基團的反應染料。 | |
673/707 | Cy5.5 (Sulfo-Cyanine5.5) 是用于標記生物分子的近紅外熒光染料，可用于小動物體內成像，也常常適用于對背景熒光干擾的實驗。 | |
673/707 | Cy5.5-SE (Cyanine5.5 NHS ester) 為 CY5 的 NHS 修飾所得，可標記多肽、蛋白和寡核苷酸中的氨基。 | |
720/790 | CY7-SE (Sulfo-Cyanine7 Succinimidyl Ester) 是一種近紅外熒光標記試劑，常用于小動物體內成像，也用來標記核酸，蛋白，多肽，納米粒，多聚物等。 |
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參考文獻
1.. X Shi, Y Jung, LJ Lin, C Liu, C Wu, IKO Cann, Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for single-molecule imagingNat Methods. 2012 Apr 1;9(5):499-503
2. JE Noble, E Cerasoli.Fluorescent labeling of protein analysis.
3. Arindam Pramanik, Zexi Xu, Shazana H Shamsuddin, et al. Affimer Tagged Cubosomes: Targeting of Carcinoembryonic Antigen Expressing Colorectal Cancer Cells Using In Vitro and In Vivo Models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022 Mar 9;14(9):11078-11091.
