1、聚丙烯酰胺的合成和結構
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acrylamide簡寫為Acr)和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(N，N1-methylene-bisacrylamide，簡寫Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯成含有酰胺基側鏈的脂肪族大分子化合物。上海創賽科技提供110-26-9，甲叉雙丙烯酰胺,N,N'-Methylenebisacrylamide,高純,99% ，商品編號：D23-S14002-100g，價格158元。
催化劑有兩個系統可供選用。
(1)過硫酸胺-四甲基乙二胺(N、N、N、N-Tetramethyl-ethylene Diamine，簡寫TEMED)系統，其中過硫酸銨是引發劑。它在光照射下裂解成帶有自由基的硫酸銨，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發動聚合反應。TEMED是加速劑，加快引發劑釋放自由基的速度。
(NH4)2S2O8→→→→→(NH4)2SO4
(2)核黃素-TEMED 系統，其中核黃素是引發劑，TEMED 是加速劑。這一催化劑系統需較強的光線和少量氧。上海創賽科技提供83-88-5，核黃素，Riboflavine，98%，商品編號：C16-R10027-100g，價格395元。
聚丙烯酰胺凝膠具有三維網狀結構，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷的多少，也與分子大小有關。凝膠網孔的大小主要受成膠物的總濃度及Acr 和Bis 的比例的影響。一般電泳采用成膠物質總濃度為7.5%，此濃度稱為標準凝膠濃度。如果改變總膠濃度，也應相應改變Acr和Bis的比例。
總膠濃度為5%以下時，Acr：Bis在20左右。
總膠濃度為5~10%時， Acr：Bis在40左右。
總膠濃度為5~20%時， Acr：Bis在125~200左右。
實驗中應根據分子量大小，選擇合適的凝膠總濃度和Acr和Bis的比例。
2、不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理
不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳是在聚丙烯酰胺凝膠支持物的介質緩沖液組成、緩沖液pH、凝膠孔徑和電勢梯度不連續的條件下進行的電泳。不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳有較高的分辨率。這是因為分離過程中不僅有電荷效應和分子篩效應(存在于分離膠中)，而且還有一種獨特的濃縮效應。下面簡單介紹不連續園盤電泳的基本原理：
(1)濃縮效應
不連續園盤電泳一般是在小玻璃管內進行的。把三種性質不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來。如圖4-3所示，上層為樣品膠，中間為濃縮膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大孔膠，應用Tris-HCl 緩沖液，其pH6.7。下層是分離膠，此層凝膠總濃度為7.5%，是小孔膠，也用Tris-HCl 緩沖液，pH8.9。上下電極槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。通電后，向陽極泳動的陰離子有三種，即Cl -，蛋白質陰離子(Pr -)和甘氨酸陰離子(Gly -)。在樣品膠及濃縮膠pH=6.7 的環境下HCl 全部電離為Cl-，甘氨酸僅極少部分電離為Gly-(甘氨酸pI=6.0)，一般酸性蛋白質也解離為陰離子。這樣，Cl –泳動最快(稱快離子)，Gly-泳動最慢(稱慢離子)，蛋白質介于其間。通電后，快離子很快超過蛋白質離子和Gly-，泳動到最前面。于是，快慢離子之間形成一個離子濃度低的區域，即低電導區域，低電導區域有較高的電壓梯度。電壓梯度驅動慢離子加速泳動。這樣，當快慢離子移動速度相等時，就建立一個不斷向陽極移動的界面。Pr –的泳動速度恰好介于快慢離子之間。因而被擠壓在快慢離子之間形成一條窄帶。這種濃縮作用可使蛋白質濃縮數百倍。血清蛋白在紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5-7個組分。而在聚丙烯酰胺凝膠電泳上則可以分為20-30個組分。
(2)電荷效應
蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質區，但由于每種蛋白質分子所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個圓盤區帶。在進入分離膠時，電荷效應仍起作用。
(3)分子篩效應
當被濃縮的蛋白質樣品從濃縮膠進入分離膠時，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH 值8.9 接近甘氨酸的Pka 值(9.7-9.8)，這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動率也增加。此時慢離子的有效泳動率超過了所有蛋白質的有效泳動率。這樣，高電勢梯度不存在了，各種蛋白質僅會由于其分子量或構型的不同，在一個均一的電勢梯度和pH 條件下，根據其通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯程度的不同，表現出不同的泳動率而被分開。上海創賽科技提供4530-20-5，叔丁氧羰基-L-甘氨酸，≥98.5%，商品編號：D16-1000956-25g，價格204元。
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