植物抗性誘導被認為是保護作物免受極端高溫（HT）影響的一種有前途的策略。然而，準確評估植物抗性誘導劑（PRIs）抗高溫能力的快速高通量方法尚未開發出來。葉綠素a熒光（ChlF）作為一種無損技術，已廣泛應用于農學、生態學、環境和植物科學等領域，特別是ChlF誘導動力學（OJIP）曲線為早期診斷提供了快速和精確的工具，以評估不同脅迫對植物生理狀態的影響。
近期，南京農業大學陳世國教授團隊提出了一種簡單高效的方法，使用英國Hansatech公司生產的植物效率分析儀Handy PEA測定快速葉綠素熒光動力學曲線和JIP-test來評估新型天然植物抗性誘導劑—2-氨基-3-甲基己酸（AMHA）誘導植物（如擬南芥、番茄）葉片HT抗性的功效。學術論文“Fast chlorophyll fluorescence rise kinetics as a high-throughput diagnostic tool for evaluating the capacity of 2-amino-3-methylhexanoic acid at inducing plant resistance against high temperature”在線發表在Environmental and Experimental Botany上。研究結果如下：
1 高溫下擬南芥葉片OJIP曲線受AMHA濃度的影響
OJIP曲線形狀的變化與光合器官的生理狀態相關，HT脅迫可以直接破壞PSII RCs中的放氧復合體（OEC），導致離開反應中心（RC）到受體側的電子流與從OEC進入RC的電子流之間的不平衡，在OJIP曲線中約200~400μs處產生K-step。在室溫（25℃）條件下，擬南芥葉片表現出典型的OJIP多相曲線。然而，在40℃ HT脅迫下，K-step成為一個主要的峰值，隨后明顯下降，直到I-step，然后一直持續到一個減弱的P-step，顯示出O-K-J-I-P瞬態曲線（圖1A，1B）。AMHA可以誘導植物對病原體和非生物脅迫的抵抗力。AMHA主要以劑量依賴的方式抑制了40℃ HT誘導的K-step的增加和P-step的減少。在1μM AMHA處理的葉片中，40℃高溫誘導的K-step幾乎被緩解，O-K-J-I-P瞬態的特殊上升也被避免，取而代之的是常規的OJIP瞬態曲線（圖1B）。因此，AMHA可以緩解HT對PSII RCs OEC的損傷。然而，與1μM AMHA相比，AMHA在其*高濃度（10μM）下對緩解O-K-J-I-P瞬態曲線的效果較差，特別是對增加的K-step上。
為了量化AMHA對HT脅迫誘導的OEC損傷的影響，作者比較了O-J相間的標準化WOJ=（Ft–FO）/（FJ-FO）和O-J相間的相對可變熒光標準化ΔWOJ=WOJ（HT）-WOJ（未處理）（圖1C）。40℃ HT處理的葉片ΔWOJ出現了明顯的正K峰，但0.1μM和1μM AMHA有效地緩解了K峰。k峰的變化可以通過JIP-test參數WK來量化。當活性OEC的比例越高時，K峰就越低。k峰的振幅（ΔWK=WK（HT）-WK（未處理））在ΔWOJ中可以清楚地觀察到（圖1C）。與對照組相比，AMHA導致40℃HT處理的葉片k峰分別下降31%（0.01μM）、44%（0.1μM）、71%（1μM）和27%（10μM）。與其他濃度（尤其是1μM AMHA）相比，10μM AMHA對K峰的增加影響較小。作者推斷，AMHA能有效地維持OEC的完整性，保護PSII的活性免受HT的脅迫。因此，可以建立一種基于葉圓片系統和OJIP曲線的方法，以評估AMHA誘導植物抗HT脅迫的活性。
圖1.高溫下擬南芥葉片OJIP曲線受AMHA濃度的影響
2 AMHA可緩解高溫條件下擬南芥葉片OJIP曲線隨溫度而發生的變化先前的研究表明，僅在中度和重度HT脅迫下，OJIP曲線才會出現明顯的K-step。本文中作者探討了6個溫度梯度下AMHA對擬南芥葉片OJIP曲線影響。在對照和1μM AMHA處理的葉片中，OJIP曲線的K-P相水平隨溫度升高而下降（圖2A）。在除25℃外的不同HT脅迫水平下，AMHA處理的葉片的K-P相均高于對照樣品（圖2A）。與25℃相比，暴露在30℃以上溫度下的葉片，無論是否存在AMHA或水，ΔWOJ都會隨溫度的升高而增加（圖2B）。此外，在相同的HT條件下，與對照相比，AMHA處理使k峰分別下降了25%（35℃）、39%（38℃）、50%（40℃）和25%（42℃）（圖2B）。在40℃高溫脅迫下，AMHA完全消除了高溫誘發的K-step，并明顯抬高了OJIP曲線。然而，在42℃HT脅迫下，AMHA并不能明顯緩解K-step出現（圖2A，2B）。這說明42℃的危害太大，使得AMHA無法防止葉片中OEC的熱損傷。因此，40℃是擬南芥葉圓片離體實驗系統中評估AMHA誘導抗高溫脅迫活性的一個更合適的高溫脅迫條件。
為了進一步優化評估AMHA誘導HT抗性能力的溫度，作者根據JIP-test參數PIABS與處理溫度之間的關系建立了一個模型，以沿著擬南芥葉片溫度梯度對HT脅迫程度進行分類（圖2）。在所有超過50個JIP-test參數中，表示PSII整體光合活性的PIABS是對各種脅迫最敏感的參數。它可以作為植物活力的指標，并對脅迫敏感性水平進行排序。如PIABS對溫度反應的排序圖（圖2C）所示，當溫度升高到42℃時，以25℃為標準的PIABS相對值明顯隨溫度升高而降低。根據相對PIABS值的下降百分比分為四個等級：無熱脅迫的常溫（20.7℃≤T≤26.4℃），PIABS下降不超過5%（0.95≤y≤1）；溫和熱脅迫溫度(26.4℃<T≤33.1℃），PIABS下降5%至25%（0.75≤y<0.95）；中等熱脅迫溫度（33.1℃<T≤40.2℃），PIABS下降25%至70%（0.30≤y<0.75）；重度熱脅迫溫度（T>40.2℃），PIABS下降70%以上（0≤y<0.3）（圖2C）。因此，本研究中使用的溫度能有效地根據擬南芥植物的JIP-test參數建立可靠的熱敏感性模型。
圖2.AMHA對不同溫度脅迫下擬南芥葉片OJIP曲線的影響
3 基于JIP-test特征參數的監測模型，用于監測AMHA誘導的耐熱水平
不同脅迫對OJIP曲線的影響可通過五十多個JIP-test參數進行量化，以探究PSII結構、構象和功能狀態的變化。熱脅迫總是對某些JIP-test參數有顯著影響，特別是那些由k-step得出的代表性參數。在所選的熱響應參數中，FO和FM與溫度升高顯著相關，但除非溫度上升到38℃或更高，否則水或AMHA處理的擬南芥葉片不會出現FO略有上升，FM大幅下降（表1）。所有與特定k-step直接相關的5個參數（FK、FK/FJ、VK、WK和OEC中心）都與HT的增加密切相關。FK值對低于40℃的輕度甚至中度熱脅迫溫度的敏感性不高。為了更好地分析HT對K-step的影響，作者引入了三個歸一化參數FK/FJ、VK和WK來評估k-step的振幅。雖然FK/FJ被認為是評估熱脅迫對PSII影響的潛在指標，但它并不能區分熱敏感植物和耐熱植物。VK和WK與處理溫度高度正相關。與VK相比，WK對高溫更敏感。在相同的高溫條件下，與對照組相比，AMHA可以明顯降低WK值（表1）。因此，可以觀察到OEC中心與高溫之間存在顯著的負相關關系（表1）。根據相關性水平，作者選擇了簡單且易于從熒光OJIP曲線原始信號中得出的VK和WK作為熱響應特征參數。此外，與OJIP曲線的IP相相關的3個參數（DVIP，δRo，和PITOT）也與溫度呈顯著正相關（表1）。IP振幅反映了電子在PSI周圍的傳遞效率，以還原末端電子受體，對幾種脅迫非常敏感。經水或AMHA處理的擬南芥葉片暴露于38℃或更高的HT時，DVIP和δRo都明顯增加，表明中度或嚴重的熱脅迫加快了PSI末端電子受體的還原速率，進而提高了潛在光合作用性能PITOT（表1）。然而，與VK和WK相比，這三個參數（DVIP，δRo，和PITOT）的溫度相關性較弱（表1）。這可能是因為PSI比PSII更耐熱損傷。因此，DVIP，δRo，和PITOT不適合評估植物的抗熱脅迫抗性。
表1 1μM AMHA對不同高溫下擬南芥葉片熱響應JIP-test參數的影響
因此，作者*終選擇PIABS和WK來建立一個模型，以確定擬南芥葉片經AMHA或水處理后的熱敏感性。在對照（圖3A）或1μM AMHA（圖3B）的情況下，PIABS和WK與處理溫度（25至42℃）之間的關系以三維圖的形式表示，顯示出非常高的相關性。與對照葉片相比，高溫下AMHA處理的葉片中WK振幅的增加幅度較小，PIABS的下降速度較慢（圖3A、3B）?？紤]到WK與溫度呈正相關，與PIABS相反，基于PIABS和WK（1/WK）的倒數，開發了一種新的超敏參數，以更好地量化PIABS和WK對溫度的聯合變化。這一合成參數PIABS/WK被定義為植物高溫敏感性（Hs）的指標。根據歸一化為25℃的PIABS/WK（Hs）對數值與高溫之間的關系，建立了擬南芥葉片中AMHA誘導抗高溫能力（Ci）的評估模型（圖3C）。Ci值是根據log（Hs）歸一化值50%抑制的溫度（命名為I50）計算得出的：Ci=I50（AMHA）-I50（水）。I50值是通過log（Hs）與水和AMHA處理過的葉片中的升高溫度之間的回歸方程確定的。AMHA的Ci值為Ci=42.51-40.02(℃)=2.49℃。與對照相比，AMHA抑制了高溫條件下log（Hs）的降低程度，尤其是在溫度超過38℃時（圖3C）。為了精確評估AMHA誘導耐高溫的能力，根據計算出的Ci的溫度范圍將耐熱性分為以下三組：低水平（0℃<Ci≤1℃）、中水平（1℃<Ci≤2℃）和高水平（Ci>2℃）。log(Hs)與升溫之間的強負相關支持了Hs是衡量植物熱敏感性的良好指標，因為其成分PIABS和WK的變化是與熱脅迫下PSII生理狀態直接相關的早期信號（圖3C）。這種方法適用于區分擬南芥葉片經AMHA處理和經水處理后的抗熱性差異。
為了進一步驗證該模型，作者還根據參數Hs得出了不同濃度的AMHA在40℃HT下的相對刺激比（Kc）。暴露于40℃高溫的擬南芥葉圓片中的相對刺激活性具有劑量依賴性的正效應（圖3D）。AMHA的濃度為0.093μM，可產生相當于50%的反應（EC50）。作者最近的研究表明，在實驗室和田間條件下，濃度為0.01至10μM的AMHA能顯著增強幾種植物對HT的抗性。因此，這種基于參數Hs的方法具有評估目標化合物誘導HT抗性活性的潛力。
圖3.評估AMHA誘導擬南芥抗高溫能力的模型
4 評估該模型在SA誘導的植物抗高溫能力中的適用性
為了驗證該模型是否適用于預測其他PRIs誘導的抗熱活性，作者使用了公認的化學誘導劑水楊酸（SA）。SA作為一種信號分子可增強多種植物對生物和非生物脅迫（包括熱脅迫）的抗性。
在本文的研究中，SA緩解了擬南芥葉片在40℃HT下OJIP曲線中K-P階段的下降和K峰的出現，并對K峰水平表現出劑量依賴性（最高達200μM）的負面影響。不同濃度的SA明顯減少了HT對PSII的OEC中心的損傷。在100μM SA的作用下，擬南芥葉片的OJIP曲線K-P階段隨溫度升高而下降的趨勢明顯緩解，尤其是在38℃及更高的HT條件下。與對照葉片相比，SA處理葉片的K峰水平分別下降了約20%（35℃時）、63%（38℃時）、64%（40℃時）和43%（42℃時）（圖4B）。這些結果與AMHA處理的葉片相似，但100μM SA保護OEC免受HT損傷的能力高于1μM AMHA（圖2B）。在不同溫度下，SA和AMHA對11個JIP-test參數的影響相似（表1）。與1μM AMHA相比，100μM SA的HT抗性誘導能力更強，因為SA的Ci值比AMHA高1.6℃。在0至200μM的范圍內，Kc與SA的濃度呈明顯的正相關（圖4D）。SA的EC50為63μM，遠大于AMHA的EC50，表明在HT脅迫下，AMHA的植物誘導能力強于SA。因此，此模型可以用來區分SA和其他PRIs誘導HT抗性能力。
圖4.通過測定SA誘導擬南芥抗高溫能力，進行模型適用性評估
5 通過植物存活和葉綠素熒光成像實驗驗證模型的可靠性
通過三種方法（植物存活率、葉綠素熒光成像和下胚軸伸長）進行的證實，AMHA和SA都能保護擬南芥植物免受高溫脅迫（圖5-7）。這與AMHA和SA通過維持PSII的效率顯著提高植物抗熱性密切相關（圖3C、4C；表1）。因此，基于OJIP曲線分析和新的JIP-test參數Hs來評估AMHA誘導植物抗HT能力的高通量模型是非?？煽康?。
圖5. AMHA和SA減輕了擬南芥的高溫損傷
圖6.AMHA和SA對高溫下兩周齡擬南芥光合效率的影響
圖7.AMHA和SA對高溫條件下擬南芥幼苗下胚軸伸長的影響
6 使用該模型評估AMHA誘導番茄的高溫抗性
為了確定該方法在不同物種中的適用性，作者選擇了番茄來評估AMHA在誘導HT抗性方面的活性。在40℃高溫處理下，在AMHA濃度從0.01μM到1μM的增加過程中，番茄葉片K峰值水平受到劑量依賴性的負面影響。與擬南芥相似，在番茄中，10μM的AMHA活性低于1μM，但高于1μM以下的濃度。將番茄葉片置于25至40℃的不同溫度下，無論用水或1μM AMHA處理，K-P相水平都會隨溫度的升高而降低。在40℃高溫條件下，對照葉片的OJIP曲線出現了明顯的K-step。然而，與對照相比，AMHA大幅提高了K-P相水平，并降低了K-step振幅（圖9A）。與對照組相比，AMHA處理的葉片的K峰分別顯著降低了約43%（35℃時）、32%（38℃時）和30%（40℃時）。經AMHA處理的番茄葉片與對照番茄葉片在30℃高溫下的K峰值水平無明顯差異（圖9B）。在不同溫度的番茄葉片中，11個具有代表性的JIP-test參數都有顯著的溫度依賴性變化。這與AMHA和SA處理的擬南芥葉片的結果不完全一致（圖2A、2B、4A、4B）。
圖8.通過評估AMHA誘導番茄抗高溫性的能力，進行模型驗證
水和AMHA處理下番茄葉片I50值分別為40.05℃和43.89，Ci為3.84℃（圖9C），幾乎是高抗性閾值（2℃）的兩倍。番茄中的EC50值為0.35μM，是擬南芥中AMHA EC50值的三倍多。因此，番茄植株需要更高濃度的AMHA才能達到擬南芥植株相同的誘導抗性水平。番茄似乎對HT比擬南芥更敏感。這也與作者的研究結果一致。顯然，這種方法對于了解擬南芥和番茄以及其他可能的植物的AMHA誘導HT抗性的能力是可靠的。
結論
在本研究中，作者利用OJIP曲線技術量化PRIs誘導擬南芥葉片抗HT的能力。研究結果表明，AMHA主要通過減輕高溫對OEC中心的損傷來維持PSII的整體活性，從而增強植物對HT脅迫的抗性。由新型JIP-test參數Hs得出的Ci和EC50是評估AMHA誘導HT抗性的有效指標。EC50越低，表明誘導HT抗性的能力越強。HT抗性誘導能力按Ci范圍分為三類：低抗性（0℃<Ci≤1℃）、中抗性（1℃<Ci≤2℃）和高抗性（Ci>2℃）。與傳統的植物存活率、葉綠素熒光成像和下胚軸伸長檢測方法相比，基于Hs參數的新模型為PRI誘導HT抗性能力的量化提供了一種高效、可靠、廉價且易于使用的工具。因此，該模型有望作為一種高通量篩選方法，用于準確預測其他候選PRIs在不同植物物種中誘導HT抗性的能力。
圖9 基于OJIP曲線和JIP-test分析技術評估AMHA誘導植物HT抗性的實驗流程
