1.瓊脂糖電泳
(1)取一定量的待測DNA樣品，用適當的限制性內切酶酶切。DNA的量根據樣品的種類及
實驗目的的不同而異，對于克隆片段的限制性內切酶圖譜分析，取0.1-0.5μg即可;而對于鑒
定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要10～20μg;當采用寡核苷酸探針或探針的比放射
性活性較低時，則需要30～50μg。
(2)酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳。
(3)電泳結束后，EB染色，長波紫外線下觀察電泳結果及照相。
2.印跡轉移
(1)切膠并作標記(左下角切除)，以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。
(2)將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h 使之變性，不間斷地輕輕搖動。
(3)將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30 min，不間斷地輕輕搖動。更換中和液，繼續浸泡15 min。
(4)將濾紙，NC膜剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉移buffer 中平衡30 min。
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(5)按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。
(6)虹吸轉移12-16h。
3.固定DNA
(1)取出轉移后的NC 膜，用濾紙吸干NC 膜，NC 膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min。
(2)用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍，每遍5min。
(3)將膜夾在兩張干燥濾紙間，80℃烘烤1-2h。
4.預雜交
(1)將膜浸入5×SSC 中 2min，將膜放入干凈的塑料袋中。
(2)將預雜交液事先在65℃ 預熱，然后將10 ml 預雜交液加入袋中，封口。
(3)65℃預雜交1h 以上，不時搖動。
5.雜交
(1)取出雜交袋，剪去一角去除雜交液后，加入5ml 雜交液及5μl 變性探針，排除氣泡后封口。
(2)將雜交袋放入65℃ 水浴中雜交過夜。
6.按下列條件洗膜
2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室溫5min /2 次
0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2 次
7.免疫酶聯檢測
(1)偶聯反應
?、儆弥泻鸵合茨?min，室溫。
?、谟梅忾]液50ml 洗膜30min，室溫，輕搖。
?、塾弥泻鸵簩⑾♂尶贵w-Dig –Ap 至 750 mU/ml ，將膜封入雜交袋，加入5 ml稀釋抗體輕搖50min。
?、苡弥泻鸵?0 ml 洗膜，10min ×2 次，室溫，輕搖，除去未結合的抗體。
(2)顯色反應①用平衡液20 ml平衡膜2min。
?、趯⒛ぱb入雜交袋中，加入5ml 顯色液，避光30min 左右，當出現顏色時不要晃動。
?、塾肨E洗膜終止反應。
?、?0℃烤干。
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