投稿方: 馬爾文儀器公司
標題：共振質量測試法在生物制藥開發中的應用
作者：Lisa Newey-Keane博士，馬爾文儀器生物制藥產品經理
本公司文號：MAL/JOB/2720
字數: 2286
圖片：共4張(僅在文件末尾提供縮略圖，高分辨率圖片文件另行提供)
圖1：在流體中測量粒子質量
圖2：共振質量測試儀器的配置(阿基米德系統，馬爾文儀器)
圖3：(自左至右)(a)，(b)及(c)：利用馬爾文阿基米德系統進行聚集體檢測
圖4：區分蛋白質聚集體和受污染硅油液滴的能力的展示
共振質量測試法在生物制藥開發中的應用
作者：Lisa Newey-Keane博士，馬爾文儀器生物制藥產品經理
預測和測量蛋白質聚集，是生物制藥配方中的一個重大難題。Lisa Newey-Keane博士描述了一種新型分析方法，可以方便地研究蛋白質的聚集。
由于在藥物研發總體經費支出中，生物分子研究工作所占的比重越來越大，因此分析測試在迅速發展的生物制藥行業受到廣泛關注。這些分子開發不僅成本高昂，而且受到嚴格監管，所以急需更適合、更嚴謹的分析測量方法。很多業內人士都提到，分析瓶頸是一個很令人擔心的問題，可能會限制藥物的開發。
與小分子藥物不同，蛋白質制劑是非合成或非結晶的，且本質上是不均勻的。正因為如此，對生物療法的純度和效力做出判定，要比對非生物分子復雜得多。例如，雜質來源繁多，包括以聚集體、錯誤折疊構象，或是以變性結構形式存在的生物分子。因此，用于保證和控制質量并提供預配方和配方必要數據所需的分析技術與制藥業中的用于小分子藥物的分析技術不同。這種復雜性和多變性，不僅給制造商，同樣也給監管機構帶來了許多新的挑戰。
挑選合適的候選分子會在其它分析中涉及各種物理化學測試過程，以排除那些有可能成為下游“問題分子”的分子。其中一個需要回答的重要的問題是，這些分子將會在配方中有怎樣的表現。而值得關注的重要領域是蛋白質聚集體，以及聚集可能引發的免疫反應。
監管機構已經明確表達了對直徑為0.2微米至2微米的蛋白質聚集體造成的潛在免疫原性的關注，但現有的粒徑測定技術，尚不足以提供這一范圍的量化數據。它們可以讓你知道有這種粒徑的粒子存在，但無法確定存在的數量。被應用于馬爾文阿基米德系統的諧振質量測定(RMM )技術能彌補這一缺陷，因為它不僅可以進行粒徑測量，更重要的是能對直徑為50納米 - 5微米的粒子進行計數。
技術簡介
共振質量測量主要是依靠一個可以檢測質量變化的機械共振結構。質量增加或減少，可以使結構的共振頻率上升或下降。由于可對頻率進行非常的測定，這就為測量質量提供了基礎。為了測量懸浮在液體上的微小顆粒的質量，共振器內置了微流體通道。當懸浮顆粒通過該結構時，它會改變共振器的整體質量，由此改變其共振頻率。如圖1所示，顆粒在位置1時進入共振器。當顆粒到達共振器末端的位置2時，對共振頻率造成的偏移達到值。而當顆粒在位置3退出時，共振頻率又恢復到基準線。
通過測量共振頻率對基準線的偏移，可以實現對粒子質量的測量。對于具有上浮力的微粒，如油滴(見下文)，則可以觀測到相反的效果，共振頻率會相對于基準線發生正偏移。
采用共振質譜測量非常小的顆粒，需要使用自身質量很小的共振器。在馬爾文阿基米德系統中，MEMS(微機電系統)傳感器能滿足這一要求。每個傳感器芯片包括一個微流體網絡和一個微小的懸臂，以一個特定的頻率發生共振。懸臂中內置一個微流體通道。當儀器中的流體系統將樣品推送經過通道時，懸臂的共振頻率會發生變化。共振頻率的變化通過激光測量，先聚焦到懸臂的頂端，然后將其發送到一個分離光電二管探測器。
每個粒子穿過傳感器都會引起一次共振頻率的變化，從而得到對樣品中單個顆粒浮力質量精準的測量，無論這個數據是正是負。通過這樣的測量，可以計算出粒子的質量、粒徑(等效球)以及表面積。同時也可對樣品濃度、密度、體積和多分散性進行整體測量。
蛋白質聚集體的定量測量
起初，蛋白質聚集體處于二聚體水平，此后直徑一路攀升到數十微米，高于這一范圍上部的聚集體通常采用流量式顯微鏡來測量。共振質量測量可應用于低于流式顯微鏡測量范圍的領域，包括那些粒徑在亞微米至幾微米、以及不易通過其他方法評估定量評估測量的粒徑。這也是免疫原性的影響之處，以及新的監管要求關注的地方。
圖3(a)為 4 μL配制緩沖液中，亞微米級IgG蛋白聚集體的粒度分布狀況。
使用RMM測量得出，粒徑大于300納米的聚集體濃度為每毫升4×106。因為測量是基于質量的，粒度分布可以用形成每種聚集體(圖3(b))的蛋白質分子(已知質量的)數量來表示。圖3(c)中列出的是，提高剪切應力一段時間后，對蛋白質樣品的測量結果，并圖示出了在整個實驗過程中，從300nm到1μm范圍內聚集體的濃度在增長。這種尺寸的聚集體出現10倍的增加，大致對應一條聚集體級聯，而亞微米聚集體的濃度與壓力下制劑質量的不好有關。
檢測污染物
蛋白質制劑分析中另一個流行的課題是硅油，它通常作為潤滑劑，存在于盛制劑的注射器和容器中。硅油常常會混入制劑中，形成與聚集體大小接近的油滴。但主要問題不是生物相容性，因為硅油滴通常被認為是安全的。更大的問題在于，在某些測量方法中，油滴會被誤認為是蛋白聚集體，因此有可能影響結果的準確性。
RMM可以通過浮力測量將硅油滴與蛋白質聚集體區分開來。例如，在圖4中，密度大于懸浮緩沖液的聚集體，是用頻率軌跡中的負峰值來表示。
硅油滴的密度一般比緩沖液的密度低，會在頻率軌跡上形成正峰值，這是因為它們的存在降低了傳感器的整體質量，從而提高傳感器的共振頻率。每一組都提供了單獨的分布情況。
今日技術
常規分析儀器使用過程中， RMM技術應用和推行成功至為關鍵的原因，在于它解決了蛋白質聚集測量中的關鍵粒度范圍這一問題。同樣重要的是，在處理小劑量貴重材料時，只需100 μL粘度達到100 cP的樣品，且無需進行樣品制備，即可進行測量。
由于能對50納米至5微米尺寸范圍內的顆粒進行檢測并計數，以及對浮力質量、干質量和大小進行可靠測量，共振質譜測量成為蛋白特性鑒定吸引力的方案。有關配方和穩定性的定量信息，可被轉化為對效能及其穩定性的信息。目前，RMM已經被用于生物制劑早期開發階段，對聚集體進行檢測和量化，這實現了“發現越早，代價越小”的理念。
正文完
[圖片]
圖1：在流體中測量粒子質量
圖2：共振質譜測量儀器的配置(馬爾文阿基米德系統)
圖3：(自左至右)(a)，(b)及(c)：利用馬爾文阿基米德系統進行聚集體檢測
圖4：區分蛋白質聚集體和受污染硅油液滴能力的展示
