PEG 400等藥物賦形劑通常被加入到制劑中以促進其在介質中溶解。然而，這些化合物卻可引發顯著的基質效應，尤其是在LC/MS/MS分析中產生的離子抑制效應。常規藥物研發流程中使用的快速LC梯度方法，容易導致此類化合物和目標分析物的共流出。由于這種共流出物已被證實是導致離子抑制效應的主要原因，因此在早期藥代動力學(PK)研究中，賦形劑濃度偏高可能會帶來棘手的問題1-3。為盡量減少這一問題引發的不良影響，目前已研究出的方法包括：LC梯度調節2,3，分析色譜柱的選擇1，樣品制備策略的方法開發1-3，樣品稀釋5，甚至是全新制劑藥的開發4。即便其中部分方法已取得成效，他們也存在各自的局限性。很顯然，分析員通常無法自己選擇制劑藥賦形劑。無論是改變梯度或流動相，還是色譜柱的選擇，LC條件的優化都能夠針對部分分析物解決這一問題，但它既無法應用到全部分析物，也需要更多的方法開發作為輔助支持。同時，對LC運行條件的過多優化并不利于高通量分析。有研究人員指出， “若能開發出一種更優化的固相萃取(SPE)方法，便可實現有效的凈化效果。 ” 3
針對以上問題，本應用紀要通過使用Oasis復合模式陽離子交換(MCX)SPE方法提供了一種可以快速、便捷、高效的解決方案。堿性分析物通過強陽離子交換作用被吸附在填料中，而如PEG等非離子型的賦形劑則通過反相機理被吸附，同時能夠在分析物洗脫之前被選擇性去除。
實驗
樣品制備
標準品包含：醋丁洛爾、美托洛爾、拉貝洛爾、咪達挫侖。這些成分分別加入到空白血漿中、調整其濃度至200 ng/mL，或是后加標到萃取后的空白血漿洗脫液中，用于回收率的計算。PEG400也是分別加入到空白血漿中調整其濃度到到5mg/mL或者后加標到萃取后的空白血漿洗脫液中用于確定回收率。
樣品按照Oasis® MCX的標準操作流程進行萃取。簡單來說，在0.5mL兔血漿中加入0.5mL 4% H3PO4進行酸化。(注意：本研究中采用的是0.5mL血漿，采用更小劑量亦可)。MCX96孔板在經過1.0mL MeOH和1.0mL H2O活化平衡之后，經酸化的樣品被上樣到填料中.上樣后，使用1.0mL 2%甲酸和2×1.0 mL MeOH清洗。樣品使用2×250μL含5%NH4OH的MeOH溶液進行洗脫。 “后加標”(PS)樣品是在空白兔血漿洗脫液中加入標準品或標準品與PEG 400的混合物。經萃取的樣品則
以以下方式制備：在未經萃取的血漿中加入200ng/mL標準品、或在其基礎上再加入5 mg/mL PEG 400。
PEG去除的回收率依據以下算式得出：% 回收率 =(萃取樣品峰面積/后加標樣品峰面積)×100%
為進行PEG去除的相關分析，樣品按照1:200的比例在流動相中進行稀釋，以避免高濃度PEG400給質譜儀帶來的污染。
方法條件
SPE條件
SPE板： Oasis MCX 96孔板30 μm (30 mg)，部件編號：186000248
液相色譜條件
液相色譜系統：沃特世ACQUITY UPLC系統
檢測：沃特世ACQUITY® SQD
樣品瓶：2 mL 96孔收集板;部件號 WAT058958
色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 x 50 mm，部件號：186002350
柱溫： 30攝氏度
樣品溫度：10攝氏度
進樣量：10μl
流速： 0.5 mL/min.
流動相A(MPA)：0.1% HCOOH水
流動相B (MPB)：0.1% HCOOH乙腈
初始流動相條件為95:5 MPA:MPB。持續0.5分鐘，MPB在2.5分鐘之后增至90%。MPB比例隨后降回5%，并持續2分鐘，重新平衡色譜柱?？傔\行時間5.0分鐘。
質譜條件
質譜系統： 沃特世ACQUITY SQD
電離模式： (+) ESI
采集范圍： SIR
毛細管電壓：2.5 kV
錐孔電壓： 根據化合物有所區別 (針對不同分析物進行優化)
脫溶劑氣體：700 L/min
錐孔氣： 0 L/min
數據管理
色譜系統： MassLynx®V4.1 SCN714和MS軟件
結果與討論
PEG 400及其他四種測試化合物的色譜圖如圖1所示。圖中寬峰是PEG400豐度較大的分子離子峰的綜合TIC，包括以下分子量的PEG單峰：370、414、458、502、546、590和634。標準品(醋丁洛爾、美托洛爾、拉貝洛爾、咪達挫侖)可通過MH+離子的SIR顯示，除咪達挫侖，它的MH+離子與(MH-35)+ 離子合并成一個峰。值得注意的是，醋丁洛爾和美托洛爾均與PEG發生共流出，因而二者更容易受到血漿樣品中殘留PEG產生的離子抑制的影響。圖2為PEG的兩個色譜圖。A圖顯示未經過SPE處理的血漿樣品中PEG含量情況。它是將PEG后加標至萃取的最終血漿洗脫液中得到的。B圖則為含有5 mg/mL PEG的血漿樣品經標準MCX流程萃取得到的，該圖表明血漿樣品中幾乎全部PEG 400都得以去除。圖3顯示為實驗所用樣品組的平均PEG峰面積，如圖所示，采用MCX萃取，超過99%的PEG 400得以去除。
按照前文方法的方程式計算分析物回收率。如圖4A所示，采用標準MCX流程后，每種分析物的回收率都超過80%。而對這四種分析物而言，平均回收率則達到95%。如圖4B所示，血漿中含有的5 mg/mL PEG 400對于分析物回收率并無影響。在含有PEG的情況下，平均回收率為103.6%。
將PEG 400從血漿中去除的主要目的就是為了清除可能引發的離子抑制效應。圖5為由下面方程式得出的基質效應數據一覽，據最新AAPS論文報道6。
基質效應 =(含PEG的峰響應值/不含PEG的峰響應值)
圖表A所示數據來源于經Oasis MCX萃取去除PEG的血漿樣品。圖表B所示數據來源于經萃取后又加入PEG的血漿樣品，可以看到在樣品制備過程中未去除PEG的結果。由圖顯示，若未去除PEG，醋丁洛爾和美托洛爾受到嚴重的離子抑制作用影響，基質效應因子分別為0.45和0.77。由上述數據可以清晰看出，那些與PEG峰共流出的分析物，使用Oasis MCX SPE板去除PEG后，離子抑制效應能得以有效清除。經PEG去除后，最終醋丁洛爾和美托洛爾的基質效應因子分別為0.93和1.04。
結論
Oasis MCX 96孔板提供了一種用于去除血漿樣品中高濃度PEG的簡便、快捷、高效的方法，從而消除早期藥代動力學研究中常見的基質效應(通常是離子抑制效應)。此外，該解決方案無需進行色譜分析方法的再開發、樣品的稀釋、及其他費時費力的流程即可成功解決上述問題，這使得整個解決方案廣泛適用于高通量分析的應用。
參考文獻
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