小兒眼病的病情準確診斷與監測一直是臨床上的一大難題，往往需要通過臨床癥狀來評判。因此，小兒眼病的診斷評估急需新的分子診斷技術的幫助。房水是眼球眼房中，介于角膜和晶狀體之間的無色透明水樣液體，主要作用為屈光、為眼內組織提供營養和氧氣、排出其代謝產物和維持眼內壓。使用前房穿刺術可以安全地取出房水，作為液體活檢樣本用于診斷和監測眼病。
研究表明，外泌體在視覺系統中可能有重要作用，如外泌體與青光眼和黃斑變性的病理生理相關。由于血-視網膜屏障存在，房水中的外泌體主要由眼內組織分泌，使得外泌體在眼病研究中更具有針對性。先前的研究中并未涉及房水外泌體的來源與分布，且由于技術手段的限制，至今尚未將房水外泌體與小兒眼病聯系起來。
基于以上研究成果與客觀需要，研究組獲取了患有不同眼病，包含先天性白內障（CAT），先天性青光眼（GLC），小兒視網膜疾?。≒RD）和視網膜母細胞瘤（Rb）的19個不同患者的房水樣本，再將Rb患者根據治療情況分為經過初步治療（診斷+初步切除）（Rb_Tn）和經過主動治療（二次切除+化療）（Rb_Tx）兩組，使用全自動外泌體熒光檢測分析系統 ExoView的配套芯片，通過抗原抗體結合捕獲了房水中的特異性外泌體，無需純化，直接檢測了房水中存在的不同亞群的外泌體的含量。
在非腫瘤眼?。–AT+GLC+PRD）和Rb_Tx組中，CD63+外泌體數量顯著高于其他表型，表明房水CD63+外泌體占大多數（圖1c）。Rb_Tn組的外泌體數量要高于Rb_Tx，說明在化療前房水中可能含有大量腫瘤分泌的外泌體（圖1d）。
圖1 ExoView檢測不同患者樣本的外泌體跨膜蛋白的表達。
（a）不同眼病樣本的外泌體熒光圖像（紅色：CD63；綠色CD81；藍色：CD9）；（b）不同患者樣本經過IgG陰性對照標準化的熒光顆粒計數表；（c）（d）不同組別樣本經過IgG陰性對照標準化的熒光顆粒計數的柱形圖。
對不同組別的各個外泌體亞群進行統計分析發現，非腫瘤眼?。–AT+GLC+PRD）和Rb_Tx組中，僅表達CD63的外泌體數量多，Rb_Tn組的亞群則更加多樣化（圖2b&圖2c）； CAT/GLC/PRD/Rb_Tx組中CD63+外泌體在CD63捕獲位點中比例高（圖2d&圖2e），而在Rb_Tn組的比例則顯著小于其他組，但CD9+/CD63+，CD63+/CD81+和CD9+/CD63+/CD81+則相對更多（圖2f）。以上結果說明，僅表達CD63的外泌體是房水中所特有的，Rb_Tn組的其他亞群則與腫瘤相關，腫瘤的治療改變了外泌體的亞群組成比例。
圖2 ExoView檢測不同組別樣本的外泌體跨膜蛋白的共定位
（a）熒光圖像示例（紅色：CD63；綠色CD81；藍色：CD9）；（b）（c）不同組別的各個外泌體亞群數量；（d）（e）（f）不同組別的各個外泌體亞群比例。
為確認ExoView芯片捕獲的是膜結構完整的外泌體，研究人員將兩份樣本經Triton-X 100處理破壞外泌體膜結構后，再使用ExoView檢測。與未經處理的樣本對比，熒光顆粒計數有顯著下降，證明實驗檢測到的外泌體是脂雙層結構完整的外泌體（圖3）。
圖3 Triton-X100處理過的房水樣品的跨膜蛋白表達。
在人的其他體液，如血漿和淋巴液中，CD63+外泌體占比僅為≤10%，而房水中CD63+外泌體的含量很高，說明CD63+外泌體可能是房水特有的。有研究表明，鼠視網膜色素上皮分泌的CD63+外泌體參與了巨噬細胞的細胞間通信。因此，CD63+外泌體可能與眼部的免疫調節相關。Rb患者房水中表型更加多樣化的外泌體來源可能是腫瘤細胞；經治療后，CD63+外泌體比例上升，說明眼部趨向正常，因此，CD63+外泌體，以及腫瘤相關外泌體亞群的含量有作為腫瘤病情監測指標的潛力。在今后的研究中，使用ExoView檢測含有更多種蛋白標志物和內容物的外泌體，可以檢測并識別更多疾病相關的蛋白標志物和內容物，助力小兒眼病的診斷和治療。
本研究中，科學家借助美國NanoView Biosciences公司研發的全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView，直接檢測病人樣本中微量的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結果直接輸出外泌體粒徑，絕對數目，蛋白表型，不同亞群的含量。多角度全方位的佐證了外泌體或可作為液體活檢樣本用于診斷和監測眼病。也說明了ExoView的無需純化，全面表征的特點是臨床液體活檢，尤其是微量檢測的一大利器。
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?同濟大學附屬上海市肺科醫院、上海思路迪轉化醫學團隊在《Journal of Nanobiotechnology》發表文章
【參考文獻】
[1] Peng, C. C., Im, D., Sirivolu, S., Reiser, B., Nagiel, A., Neviani, P., ... & Berry, J. L. (2022). Single vesicle analysis of aqueous humor in pediatric ocular diseases reveals eye specific CD63‐dominant subpopulations. Journal of Extracellular Biology, 1(4), e36.
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