【基本原理】
真核生物的DNA主要存在于細胞核內,以雙鏈線性高分子形式存在。DNA提取的主要過程是:破碎組織和細胞,去除與核酸結合的蛋白質及其它多糖、脂類等生物大分子,本實驗通過蛋白酶K 和SDS 使蛋白質變性,再用酚/氯仿除去蛋白質,用乙醇使DNA 沉淀,經A260/A280檢測DNA含量,再經瓊脂糖電泳鑒定。
【器材】
1.玻璃勻漿器
2.臺式離心機
【試劑】
1.DNA提取緩沖液:
10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
0.1mol/L EDTA (pH 8.0)
20μg/ml 胰RNA酶
0.5% SDS
2.蛋白酶K 20mg/ml
3.飽和酚
4.NaAC(pH5.2)3 mol/L
5.1×TE(pH8.0)
6.100%乙醇
7.70%乙醇
【操作步驟】
1.取新鮮肝組織0.2g,加1.2ml DNA提取緩沖液制成勻漿,勿使細胞核破碎。
2.加6μl RNase(20mg/ml),倒入Ep 管中,37℃水浴保溫30min,然入加6μl蛋白酶K(終濃度50μg/ml),50℃保溫2h。
3.取0.5ml 保溫液,加0.5ml 飽和酚,充分振蕩混勻,于10 000rpm離心10 min,將上層水相轉入Ep 管中,加等體積氯仿/異戊醇(24:1),充分混勻后,10 000rpm 離心10min。
4.上層水相轉移至Ep管中,加50μl 3mol/L NaAc,加2-2.5倍體積的無水乙醇,離心同上。
5.小心棄出上清,沉淀加70%乙醇離心洗滌一次,保留沉淀,使之自然干燥,加適量的水或TE溶解。
6.進行核酸定量測定和電泳鑒定。
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