Feulgen染色是經典顯示去氧核糖核酸的方法,DNA定量測定的主要染色方法之一。
反應原理
標本經稀鹽酸水解后,DNA分子中的嘌呤堿基被解離,從而在核糖的一端出現了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應,形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發色團,故可呈現出紫紅色。也就是說, DNA經稀酸水解后產生的醛基,具有還原作用,可與無色品紅結合形成紫紅色化合物,從而顯示出DNA的分布。
反應方程式
2HCl Na2S2O5→2NaCl SO2 H2SO3
DNA是主要的遺傳物質,集中于染色體上。1924年孚爾根首先用席夫試劑(Schiff)作試驗,鑒定了染色體上DNA的存在,故稱為孚爾根染色法。孚爾根染色法的反應原理主要與席夫試劑的化學性質有關,此試劑的基本成分是堿性品紅,偏亞硫酸氫鈉(NaHSO3)和鹽酸.堿性品紅的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。上海創賽科技提供亞硫酸氫鈉(AR),Sodium bisulfate,7631-90-5,商品編號:C84-2756-500G,價格76元。
堿性品紅原為桃紅色,當與亞硫酸作用時被氧化,使醌型變為苯型,由桃紅色變為無色透明的N-亞磺酸亞硫酸副品紅堿,當它與醛基作用時,其分子式又恢復為醌型結構,呈現紫紅色。上海創賽科技提供堿性品紅,AR,632-99-5,商品編號:D16-1009943-25g,價格29元。
利用1M HCl 、60℃下水解時,可將DNA分子中嘌呤堿基與去氧核糖之間的糖苷鍵打斷,使嘌呤脫下,并使去氧核糖C-1位置釋放醛基與席夫試劑反應顯紫紅色。細胞中只有DNA才具有這種專一的孚爾根反應,因此利用孚爾根反應,可以鑒定DNA的存在。并廣泛應用于核及染色體的研究中。
實驗注意
固定劑中,以OsO4和Carnoy效果較好,OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反應的理想固定劑,只是因OsO4價錢較貴,故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反應中,不能單獨使用Bouin定液,因為它是Feulgen反應的最壞固定劑,但經Aller改進后的Bouin-Aller固定液效果卻較好。上海創賽科技提供乙醇胺(色譜固定液,30℃),Ethanolamine,141-43-5,商品編號:C84-103805-100ml,價格170.5元。
Feulgen反應通常用稀酸進行水解,但水解的時間一定要適當。如水解時間不夠, 反應就會變弱;如水解時間過長或水解地過于劇烈,則脫氧核糖也易掉下來,反應也會減弱。適當的水解時間一般為8~12min。但是水解時間長短也要視標本的類型(如厚薄等)、固定劑的性質以及酸的濃度而定。
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