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        1. 教育裝備采購網
          體博會25 校體購2

          中性蛋白酶產品應用說明及產品應用領域

          教育裝備采購網 2020-05-11 10:40 圍觀1382次

            注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

            測定意義:

            NP在一定的溫度和中性pH條件下,催化水解蛋白質。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點,中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養保健品生產。

            測定原理:

            中性條件下,NP催化酪蛋白水解產生酪氨酸;在堿性條件下,酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍;在680nm有特征吸收峰。

            自備儀器和用品:

            可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、1.5mL EP管和蒸餾水。

            試劑組成和配制:

            試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

            試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

            試劑三:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加入4mL試劑一,沸水浴中磁力攪拌溶解。

            試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加20mL蒸餾水溶解。

            試劑五:液體×1 瓶,4℃保存。

            標準品:液體×1 支,0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液,4℃保存。

            粗酶液提?。?/p>

            1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即粗酶液。

            2. 血清或培養液:直接測定。

            3. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

            測定操作:

            1.分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到680nm,蒸餾水調零。

            2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

            3.對照管:取0.5mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑二,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑三,混勻后8000g,4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm測定光吸收,記為A對照管。

            4.測定管:取0.5mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL試劑三,混勻后置于30℃水浴保溫10min;加入40μL試劑二,混勻后10000rpm 4℃離心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm測定光吸收,記為A測定管。(注意與空白管不同,先加試劑三,后加試劑二)

            5.空白管:取0.5mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測定光吸收,記為A空白管。

            6.標準管:取0.5mL EP管,加入40μL標準品,200μL試劑四,40μL試劑五,混勻后置于30℃水浴保溫20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm測定光吸收,記為A標準管。

            注意:空白管和標準管只需要測定一次。

            計算公式:

            a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

           ?。?)按蛋白濃度計算

            NP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min/mg prot)= C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr

           ?。?)按樣本質量計算

            NP活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min /g)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

           ?。?)按照液體體積計算

            NP活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min/mL)=C 標準品×(A測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×稀釋倍數÷V1÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

           ?。?)按照細胞數量計算

            NP活性單位定義:30℃每104個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min /104cell)=C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×稀釋倍數÷(細胞數量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷細胞數量

            C 標準品:0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液;稀釋倍數:(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定,需要另外測定;建議

            稱取同樣質量的樣品,加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后,用本公司蛋白質含量測定試劑盒

            測定;W:樣品質量(g);V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10 -2mL;V2:

            粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應時間(min),10min。

            b.使用96 孔板測定的計算公式如下

           ?。?)按蛋白濃度計算

            NP活性單位定義:30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min /mg prot)= C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×稀釋倍數÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

           ?。?)按樣本質量計算

            NP活性單位定義:30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min/g)=C標準品×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×稀釋倍數÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W

           ?。?)按照液體體積計算

            NP活性單位定義:30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min/mL)=C 標準品×(A測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×稀釋倍數÷V1÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

           ?。?)按照細胞數量計算

            NP活性單位定義:30℃每104個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

            NP活性(nmol/min /104cell)=C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×稀釋倍數÷(細胞數量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷細胞數量

            C 標準品:0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液;稀釋倍數:(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定,需要另外測定;建議

            稱取同樣質量的樣品,加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后,用本公司蛋白質含量測定試劑盒測定;W:樣品質量(g);V1:加入反應體系中粗酶液體積(mL),20μL=2×10-2mL;V2:粗酶液總體積(mL),1mL;T:催化反應時間(min),10min。

            注意事項:

            臨用前配制的試劑配制好后4℃保存,并且3 天內使用完畢。

          點擊進入優選生物展臺查看更多 來源:教育裝備采購網 作者:上海酶科生物科技有限公司 責任編輯:陽光 我要投稿
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