<acronym id="pokdi"><strong id="pokdi"></strong></acronym>
      <acronym id="pokdi"><label id="pokdi"><xmp id="pokdi"></xmp></label></acronym>

      <td id="pokdi"><ruby id="pokdi"></ruby></td>
      <td id="pokdi"><option id="pokdi"></option></td>
      <td id="pokdi"></td>

        1. 教育裝備采購網
          第八屆圖書館論壇 校體購2

          ELISA技術應用概覽和方法學開發初析

          教育裝備采購網 2018-07-03 15:47 圍觀2245次

            ELISA技術應用概覽和方法學開發初析

            簡簡介介

            本文適用于已有過ELISA應用相關經驗,對ELISA問題排查和方法開發有進一步需求的廣大科研人員,更加適用于ELISA相關醫療診斷試劑盒開發,體內藥代藥動相關大分子檢測,抗體結合活性質控等在合規方面有方法學驗證要求的藥物研發工業領域從業者。ELISA檢測技術的間接性,應用領域的廣泛性,樣品來源的復雜性和試劑各成分反應過程的可逆性導致ELISA的方法開發和實際的使用過程中會出現各種異常情況,本文的目的是區分ELISA的使用目的,明確目的相關ELISA方法的檢驗標準,分步解析ELISA間接檢測的信號傳遞過程以及傳遞偏差對檢測方法的影響,簡略探討免疫反應(配體-受體結合)的化學本質和數學原理,并重新評估棋盤法在ELISA方法開發的指導意義,倡導以使用目的為導向通過方法學驗證為目標的ELISA方法學開發。

            ELISA應用

            ELISA檢測技術早在19世紀70,80年代就開發出來用于替代放射性同位素標記技術用于研究蛋白質間的相互作用(配體-受體,抗原-抗體),到如今已經接近50年的歷史了。這個技術從科研的角度來說已經不具備第一性,沒有太多的價值,不值得專門進行研究,更多的是一個使用的工具。工業應用落后于基礎研究,ELISA技術在制藥領域的應用隨著近20年生物制藥領域的迅猛發展展現著越來越多的使用價值,當然ELISA的應用情況也越來越復雜,這樣的復雜性也使得早期的基礎研究并不再具有很好的指導意義,ELISA方法濫用錯用往往導致實驗結果出現系統性偏差,影響實驗結果的真實性,做出錯誤的選擇。本文的寫作目的旨在作為文獻之外關于ELISA實際應用的一個總結,反補基礎研究的不足,使得該技術更具使用價值。

            從早期抗體發現階段,雜交瘤的滴度測定,噬菌體展示的淘選篩選;抗體的穩轉,瞬轉和發酵過程的表達量監控,體外抗體和對應靶點蛋白或細胞表面受體的親和力評價,細胞因子的監控,體內抗體藥物的藥代動力學,藥效生物標志物的含量檢測和免疫原性測定等均會使用ELISA技術。ELISA技術可以說是一個通用的,入門十分簡單,應用面十分廣泛,高通量的技術。小木蟲,丁香園等關于ELISA的問題經久不衰,ELISA技術由于其檢測的間接性(信號進行了多重傳遞),使用目的的差異性和樣品來源的復雜性導致ELISA方法一旦出現異常實驗地操作者很多時候很難進行問題排除。小編有過多年的ELISA相關應用方法學的開發經驗,進行了多個ELISA應用的開發和方法學驗證,從一個ELISA方法開發和ELISA平臺技術搭建者的角度,對ELISA方法應用進行梳理和系統分析。

            使用目的

            從使用目的來說,ELISA方法可以分為兩類。第一類:生物大分子的定量,第二類:親和力測定評價或者篩選??贵w的穩轉、瞬和發酵過程的表達量監控,細胞因子的監控,體內抗體藥物的藥代動力學,藥效生物標志物的含量檢測和免疫原性測定等可劃分為第一類使用目的,雜交瘤的滴度測定,噬菌體展示的淘選篩選,體外抗體和對應靶點蛋白或細胞表面受體的親和力評價可劃分為第二類使用目的。使用目的不一樣,即使使用同樣的試劑材料,也會有不同實驗模式和擬合曲線。下面小編將以某抗體的定量的方法開發(第一類目的)和親和力檢測方法開發(第二類目的)為例,對不同使用目的開發策略進行介紹。

            該方法的檢測體系如下,靶點蛋白(抗原)包被,樣品(人抗體)進行反應,酶聯二抗為羊抗人HRP偶聯多抗,顯色液為TMB顯色液。使用目的是對樣品進行定量和親和力分析。

            如表一,表二,采用相同的試劑材料,不同的試劑相對濃度得到了如圖1不一樣的劑量曲線來滿足不同的使用目的。而兩個方法最核心的不同在于包被抗原的量相對于梯度稀釋樣品的量,如果一個ELISA需要達到精密,準確等驗證需求,在定量方法的開發過程中包被抗原的量要遠遠大于標準品(樣品)的量,這樣樣品能夠抵消抗原抗體可逆反應的影響,使得近似所有的抗體樣品均被捕捉到,標準曲線如果做對數線性擬合能夠得到非常好的線性。在親和力評價中,這跟同位素標記測配體受體的親和力的原理一致,包被少量的包被抗原,采用飽和浸潤法即包被抗原的量相對于樣品的量是由遠遠小于抗原的量到遠遠大于抗原的量的過程,需要有完整的上下漸進線,S型曲線,其EC50即親和力數值(解離平衡常數)。兩個使用目的采取的實驗條件涉及到抗原抗體可逆反應化學原理的數學推導,鑒于多寫一個數學公式可能會使讀者少上不少,公式推導已做省略,不同使用目的的假設推導過程也給出,有志于深耕ELISA領域的讀者可以好好研究下。

            采用相同的實驗材料,不同的試劑配比以分別達到生物大分子定量和親和力評價的使用目的并進行對比的研究,至目前為止,小編并未在任何文獻上見到過類似的研究,但是在實際的應用過程中達到了很好的效果,這也是小編想把這篇文章寫下來,期望借助互聯網的力量把這個不具有很大的科學價值但是有很廣泛的使用價值的技術進行傳播討論,達到越辯越明的目的。

            ELISA方法的檢驗標準

            當然,從一個藥物研發從業者的角度來看,開發出來的方法需要進行方法學驗證,符合相關法律法規后才能夠確認成功,這是從質量分析控制的尺度去對一個ELISA方法進行評估,可以說是最為嚴格的評估方式。這個工作可能主要集中在質量控制相關的部門,涉及到一個檢驗方法好壞的評價標準,小編正好也負責過幾個ELISA方法的驗證工作,簡單介紹下,涉及到相關的法律法規,具體實驗細節和程序以法規為準。

            生物大分子定量方法學驗證

            ELISA方法的第一類使用目的是生物大分子定量,這個可以參考2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。里面有比較細致關于生物大分子定量方法的準確度,精密度,線性和范圍,耐用性等方面的驗證要求。在小編看來,在ELISA 定量開發出來后如果初步判斷一個檢測方法能否通過驗證,主要看兩點,第一點是標準品的曲線擬合后的回測偏差是否在比較合適和穩定范圍內(最佳±10%),第二就要看標準品和待測樣品在檢測體系中是否具有相同的免疫學特性(平行性)。這個可以通過梯度稀釋樣品信號代入標準曲線,經稀釋倍數校正后測定的濃度值在各稀釋倍數是否吻合來判斷。相同的免疫學特性是一個非常重要的概念,也是一個方法開發是否成功的關鍵。免疫學特性不僅僅指的待測樣品和包被抗原的親和力特性,也包含待測樣品和酶聯抗體的親和力特性。即使是同樣的物質,當樣品經過體內代謝循環后其免疫學特性有可能發生改變,那么未經體內代謝的對照品是否能夠作為標準品需要經過平行性驗證。即使不同的物質,只要有相同的免疫學特性,也能夠進行準確定量,小編就搭建了雙抗Fc方法(包被為抗Fc抗體,酶聯抗體也為抗Fc抗體-HRP)作為通用方法,IGg作為對照品進行多個抗體和融合蛋白的常規檢測,經過分子量校準后的檢測結果和純化后紫外的檢測結果有可比性。

            親和力測定驗證(相對結合活性方法學驗證)

            親和力指得是抗體和靶點抗原的解離平衡常數,是一個非常重要的生物特性。在質量控制過程中,常用ELISA方法進行不同批次或者長期穩定性樣品的親和力評價。親和力一般來說是絕對值,但是由于生物實驗的復雜性,材料批次的替換可能會影響到樣品的親和力檢測準確性,常會引入一個默認質量屬性不會變化的對照品作為參比品,待測樣品和參比品一同進行檢測來抵消材料造成的偏差,并計算待測樣品相對于參比品的親和力(相對結合活性)

            生物功能學方法的評價中國藥典目前沒有詳細的指導標準,只有宏觀的分析方法準確度,精密度,線性和范圍,耐用性等要求,FDA在USP1032,USP1033,USP1034有比較詳細和完整的生物功能學方法驗證方案設計,實驗結果統計學分析的案例,可以用來評價ELISA建立的親和力評價方法的質量。

            系統分析:信號進行了多重傳遞和傳遞過程可能出現的偏差

            ELISA是一個間接的檢測過程,這在很多文獻資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細的描述間接測量的信號傳遞過程,以及傳遞過程中出現的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個角度對ELISA進行系統分析,該分析有助于搭建穩定的ELISA平臺,并正確地使用和評估不同性質的酶聯抗體和顯色液等通用材料。

            如圖2所示,宏觀上來講,ELISA檢測的函數曲線在實際操作過程中描述的是劑量濃度的抗體和信號之間的相關關系,而其實質是為了描述劑量濃度的抗體和對應抗原-抗體偶聯物之間的相關關系??乖?抗體偶聯物經過了酶聯抗體反應和酶催化放大反應,催化產物檢測后轉換成信號。該信號間接的代表了抗原-抗體偶聯物。這種間接的轉化過程經歷了三重信號的傳遞過程,而只有在三重傳遞保證線性的情況,抗體濃度-信號劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯物濃度劑量曲線,如果進行了非線性傳遞將會影響到整個檢測方法的真實性和準確性,下面小編將從微觀角度簡單介紹下信號傳遞過程中可能存在的偏差。

            1.信號檢測偏差:酶催化產物轉換成信號時有可能會產生的偏差,這個偏差在一些文獻中也稱之為儀器的非線性檢測區域,即當酶催化產物濃度過高時,催化產物濃度和信號值之間不完全呈線性關系,這個現象是普遍存在的,如圖3所示某品牌酶標儀的參數性能,注意該儀器的測量范圍是0-4 OD,而該儀器確保的檢測線性范圍是0-3 OD。一般來講在進行吸光度法讀數時,檢測的信號值最高值控制在3左右。如果兩個相鄰的抗體濃度點對應的信號值在OD值3.5及以上時都會特別接近,這兩個信號值很有可能是有信號傳遞偏差的。這個可以通過高濃度的酶催化產物梯度稀釋查看信號的線性范圍確認。

            2.酶催化反應傳遞偏差:該偏差是由酶催化顯色液引起的,其實質是酶聯抗體的濃度和其對應催化產物的濃度是否線性相關。如圖4所示由于酶催化反應在未終止前是一個持續反應的信號放大過程,信號的產生是時間的累積量,在反應過程中酶活可能會喪失(左),顯色液的有效成分在不斷的減少時,梯度濃度的酶催化反應在反應時間內的可能不會是勻速反應狀態(右)。

            這個可以通過動力學讀數進行確認。目前市面上有多種顯色液可供選擇,顯色能力最強和最弱的產品信號差異可能達到20-50倍,需要根據實驗的目的正確的選擇顯色液并確認酶催化過程的線性傳遞。

            3.酶聯抗體反應傳遞偏差,即酶聯抗體和抗體抗原偶聯物反應后,酶聯抗體-抗原抗體偶聯物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯物的濃度。這個比較復雜的過程,主要是因為酶聯抗體的異質性導致的,酶聯抗體多為多抗,該抗體偶聯上的HRP分子數目也存在差異,很難用單一的實驗去論證這個線性過程。但值得注意的是,酶聯抗體加入反應濃度應該遠大于抗體抗原偶聯物的濃度,這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯物都被轉換成酶聯抗體-抗原抗體偶聯物,酶聯濃度加入過少會導致劑量曲線的高濃度點出現假平臺期,影響實驗的結果;酶聯濃度過高可能會導致非特異信號的增加,還有酶聯濃度的增加會導致信號的增加,可能會導致信號值超過線性檢測范圍。所以酶聯濃度的反應濃度是一個值得選擇的參數。

            免疫反應(配體-受體結合)的化學本質和數學原理解析

            如果一個ELISA實驗間接的檢測過程保證信號的線性傳遞,我們就可以研究下抗體和抗原這樣一個可逆反應的過程,以及其化學原理,數學原理和假設。

            假設我們考慮的是不涉及多步反應的簡單的可逆反應的過程。即Ag和Ab反應生成二元復合物Ab·Ag,Ag,Ab,Ab·Ag之間地可逆反應,正反應是二級反應,其反應速率常數為Kon,逆反應為一級反應,即逆反應速率常數為Koff,即:

            Ab:包被的酶標板條上的固定抗體 Ag:分析物

            [Ab]:包被在酶標板條上的固定抗體的含量

            [Ag]:待檢測的分析物的含量

            [Ab·Ag]: Ag和Ab反應后形成的偶聯物的含量

            [Ag]f:反應進程中,尚未和Ab結合的自由地Ag的含量

            [Ab]f:反應進程中,尚未和Ag結合的自由地Ab的含量

            Kd= KoffKon 1.0

            Ab·Ag的生成速度可表示為公式1.1

            d[Ab·Ag]dt = Kon[Ag]f[Ab]f 1.1

            Ab·Ag的解離速度可表示為公式1.2

            -d[Ab·Ag]dt = Koff[Ab·Ag] 1.2

            由1.0-1.2可以進行簡單的數學推導得到下面兩個公式(推導過程略)

            即:

            [Ab·Ag] =Ag [Ab]fKd+ [Ab]f 1.8.1

            或[Ab·Ag] =Ab [Ag]fKd+ [Ag]f 1.8.2

            假設:[Ab]? [Ag],則[Ab]?[Ab·Ag],則 [Ab]f= [Ab] - [Ab·Ag]≈[Ab],1.8.1可轉換成

            [Ab·Ag]=Ag [Ab]Kd+ [Ab] =[Ag]KdAb+1 1.9

            當[Ab·Ag]=1/2 [Ag] 時,Kd=[Ab] 1.10

            假設:[Ag]? [Ab],則[Ag]?[Ab·Ag],則 [Ag]f= [Ag] - [Ag·Ab]≈[Ag],

            1.8.2可轉換成

            [Ab·Ag]=Ab [Ag]Kd+ [Ag] =[Ab]KdAg+1 1.11

            如果:[Ag]? Kd 則Kd/[Ag]≈ 0 , 公式1.11可轉換為

            [Ab·Ag]≈[Ab], 1.12

            即檢測到的[Ab·Ag]的量約等于[Ab]的量

            兩邊取log以消除不同濃度點的方差差異得

            Log[Ab·Ag]≈Log [Ab] 1.13

            [Ab·Ab]只有經過酶聯抗體反應和酶催化反應的線性放大后才能得到

            Log(OD)=a Log [Ab] + b 1.14

            這樣一個數學推導過程并不困難,如果短時間內不能理解可以看后續的討論

            兩個假設具有十分重要的指導意義在于:

            如為得到1.9的公式所做的假設,公式1.8.1只有當包被的抗原的濃度遠遠小于加入反應的抗體的濃度時,劑量曲線的EC50的抗體濃度值才能代表抗體抗原間的親和力常數Kd。這個即ELISA親和力檢測方法模型,經歷了一重假設。該假設是包被的抗原的濃度要遠遠少量。

            為得到1.14的公式,所做的假設,公式1.8.2只有當包被的抗原的濃度遠遠大于加入反應的抗體的濃度時,且包被的抗原的濃度遠遠大于Kd值時劑量曲線的才能進行對數擬合(文章之初用四參數擬合代替對數擬合是另一個故事,有機會再講)。這個即ELISA定量檢測方法模型,經歷了二重假設。該假設分別是包被的抗原的濃度要遠遠大于反應抗體的濃度,包被的抗原的濃度遠遠大于Kd(親和力,解離平衡常數),在這兩個假設中包被的抗原的濃度都要遠遠過量,抗體和抗原的Kd要越小(強親和力)。

            ELISA方法開發之棋盤法

            小編在上文中初步區分ELISA的使用目的,明確目的相關ELISA方法的檢驗標準,分步解析ELISA間接檢測的信號傳遞過程以及傳遞偏差對檢測方法的影響,探討免疫反應(配體-受體結合)的化學本質和數學原理解析,現在我們來看看文獻資料對ELISA方法開發的指導,截止目前為止小編看到的對于ELISA方法開發的指導均是經典的教科書式的棋盤法。

            如表三所示,棋盤滴定法即將包被抗原和酶聯抗體分為作橫縱系列稀釋,待檢測樣品(對照品)加入高,低和零濃度進行反應,在一塊96孔板中進行多個條件的排列組合,通過檢測的信號值即零樣品組的背景信號值小于0.1,低濃度組有和背景信號區分的信號值,高濃度組的信號值和背景信號有比較大的信噪比來選擇合適的條件。

            在實際的操作過程中,根據這樣的標準能夠選出多個符合標準的條件組合(黃色區域和藍色區域),這樣的方法在ELISA方法開發的初期并未起到很好的指導意義。選擇其中的一個條件組合繼續走下去進行方法的開發可能最終通不過方法學驗證,然后重新進行另一個條件組合的嘗試和方法學驗證,是一個十分低效的過程。

            ELISA方法開發之初析

            如何進行高效地進行一個方法學開發?

            首先小編認為我們需要明確ELISA方法開發的目的,如之前的化學原理分析和數學推導,如果是進行大分子定量,包被的抗原遠遠過量是方法穩定的必然選擇;如果是進行ELISA的親和力分析,包被的抗原少量是方法穩定的必然選擇。這樣也就減少了一個變量,排除了大部分的可能。根據經驗,96孔板一個孔的抗原載量是有限的,如果是進行定量方法的開發,包被的抗原濃度為5μg/ml,100μl足以過量,而進行親和力方法開發,常用的包被的抗原濃度為100ng/ml,100μl或者200ng/ml,100μl.

            其次要做好平臺的搭建工作,確認通用的顯色液和酶聯抗體等試劑在信號傳遞過程中是否有可能存在偏差,即信號檢測偏差,酶催化反應偏差和酶聯反應偏差。

            第三是熟悉不同使用目的的ELISA方法的方法學驗證標準。在方法學開發的初期就是以通過驗證為最終目標進行方法學開發。

            展望

            以上只是一個簡而概之的進行ELISA方法開發的描述,作為一門實驗技術還需要在正式的實驗操作中去體會,很多不同廠商來源的酶標板材,酶聯抗體和顯色液,樣品的復雜程度等均會影響到實驗的效果,需要實驗人員去了解各試劑耗材的物性,駕馭好信號值的大小變化。一個好的實驗模板會少走很多彎路,節省很多不必要的花費,小編能夠保證的是文章開篇的定量方法開發和親和力方法開發的實例是一個比較好的模板以供參考。需要說明的是本文描述的均是非競爭法條件下進行ELISA方法學開發,競爭ELISA法進行定量和親和力檢測有更加復雜的機理和更多的變量條件需要確認,這是另一個故事。

            ELISA是一門實踐性很強的技術,其整個方法過程中經歷了多重的信號傳導,間接的檢測過程使得該方法在實際使用過程中充滿了迷霧,一個宏觀全局的把控認知和微觀細微的分步實驗分析是搭建好一個可以進行多方面應用ELISA平臺的關鍵。在小編看來ELISA實驗方法不是“一千個人眼中有一千個哈姆雷特”,而是”所有幸福的家庭是相似的;每個不幸的家庭各有各的不幸”。

          點擊進入黃石研科生物科技有限公司展臺查看更多 來源:教育裝備采購網 作者:研科生物 責任編輯:張肖 我要投稿
          校體購終極頁

          相關閱讀

          • 衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)
            教育裝備采購網12-18
            衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)ELISA試劑盒本試劑盒只能用于科學研究,不得用于臨床診斷。以下文字為產品簡介,詳情以說明書為準,可QQ或聯系在線客服索取。使用目的衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF...
          • 植物甜菜堿(Betaine)ELISA試劑盒——上海一基實業
            教育裝備采購網11-25
            植物甜菜堿(Betaine)ELISA試劑盒本試劑盒只能用于科學研究,不得用于臨床診斷。以下文字為產品簡介,詳情以說明書為準,可QQ或聯系在線客服索取。使用目的植物甜菜堿(Betaine)ELISA試劑盒適用于...
          • 植物絲裂原的蛋白激酶;MAP激酶——上海一基實業
            教育裝備采購網11-25
            植物絲裂原的蛋白激酶;MAP激酶(MAPK)ELISA試劑盒本試劑盒只能用于科學研究,不得用于臨床診斷。以下文字為產品簡介,詳情以說明書為準,可QQ或聯系在線客服索取。使用目的適用于檢測人動植物組織...
          • 植物絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)——上海一基實業
            教育裝備采購網11-25
            植物絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)ELISA試劑盒本試劑盒只能用于科學研究,不得用于臨床診斷。以下文字為產品簡介,詳情以說明書為準,可QQ或聯系在線客服索取。植物絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT)ELISA試...
          • 年中慶撞上兒童節,各種爆棚的優惠
            教育裝備采購網05-31
            年中慶撞上兒童節,elisa試劑盒/標準品/對照品各種爆棚的優惠,如期到來的兒童節剛剛好趕上周六,才能很好的帶著娃,一起吃吃喝喝玩玩樂樂,更要買買買……年中慶恰巧與6.1擦出火花,俗話說的好...
          • 人p11 ELISA試劑盒操作注意事項

            人p11 ELISA試劑盒操作注意事項
            教育裝備采購網05-17
            人p11ELISA試劑盒已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素...
          • 小鼠半乳糖凝集素3(Gal-3)ELISA試劑盒使用說明
            教育裝備采購網01-18
            小鼠半乳糖凝集素3(Gal-3)ELISA試劑盒使用注意事項(1)試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。(2)實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以...
          • 牛曼氏桿菌抗體(M. haemolytica-Ab上海一基實業
            教育裝備采購網10-12
            牛曼氏桿菌抗體(M.haemolytica-Ab)ELISA試劑盒自備材料1)蒸餾水。2)加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3)振蕩器及磁力攪拌器等。牛曼氏桿菌抗體(M.haemolytica-Ab)ELIS...

          版權與免責聲明:

          ① 凡本網注明"來源:教育裝備采購網"的所有作品,版權均屬于教育裝備采購網,未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用。已獲本網授權的作品,應在授權范圍內使用,并注明"來源:教育裝備采購網"。違者本網將追究相關法律責任。

          ② 本網凡注明"來源:XXX(非本網)"的作品,均轉載自其它媒體,轉載目的在于傳遞更多信息,并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責,且不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。如其他媒體、網站或個人從本網下載使用,必須保留本網注明的"稿件來源",并自負版權等法律責任。

          ③ 如涉及作品內容、版權等問題,請在作品發表之日起兩周內與本網聯系,否則視為放棄相關權利。

          校體購產品
          99久久国产自偷自偷免费一区|91久久精品无码一区|国语自产精品视频在线区|伊人久久大香线蕉av综合

            <acronym id="pokdi"><strong id="pokdi"></strong></acronym>
              <acronym id="pokdi"><label id="pokdi"><xmp id="pokdi"></xmp></label></acronym>

              <td id="pokdi"><ruby id="pokdi"></ruby></td>
              <td id="pokdi"><option id="pokdi"></option></td>
              <td id="pokdi"></td>