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        1. 教育裝備采購網
          第八屆圖書館論壇 校體購2

          ELISA實驗常見問題及解決方案

          教育裝備采購網 2018-04-16 14:11 圍觀726次

          問題

          序號

          可能原因

          解決方法

          顯色淡,靈敏度偏低

          1

          試劑盒未充分平衡

          試劑盒從2~8℃冰箱取出后打開盒蓋,于室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)

          2

          樣品不適合做ELISA檢測

          樣品一般選擇培養上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件(例如稀釋液的成分)

          3

          酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥

          防止板過于干燥

          4

          包被抗體遭到破壞

          操作溫和,移液槍不能碰到孔底

          5

          樣本和抗體孵育條件不合適

          按照說明書條件,建議孵育過程中全程振蕩孵育。

          6

          洗滌浸泡時間過長

          按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間;

          7

          偶聯HRP試劑污染

          棄去試劑,重新配置

          8

          錯誤的稀釋偶聯HRP試劑

          棄去試劑,重新配置

          9

          TMB底物孵育時間過短,因非人為因素影響,需要優化孵育時間

          確定合適的孵育時間:人為判定-最高濃度的標準品出現深藍色;S4-5有淡藍色;機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65

          10

          樣本濃度過高或存在基質效應

          建議做不同稀釋倍數,確認樣本最佳稀釋倍數。

          11

          酶標儀濾光片設置有問題或者波長選擇不對

          確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。

          12

          酶標板不適合做ELISA

          不能使用細胞培養板,建議使用ELISA專用高吸附力板子。

          背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

          1

          洗滌不充分,洗后未拍干,樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留

          洗液準確配制;充分洗滌,靜置15秒,徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染。

          2

          底物污染,未避光保存,出現顏色

          棄去底物,重新配置

          3

          樣品稀釋液污染

          棄去稀釋液,重新配置

          4

          吸頭重復使用,未洗凈或消毒不徹底

          吸頭盡可能一次性使用

          5

          不正確的孵育時間,溫度(尤其是底物孵育的時間)

          最為常用的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2~8℃。完全按照說明書要求。

          6

          偶聯抗體(streptavidin-HRP)濃度過高

          按照說明書調整到最佳的濃度

          7

          ELISA板子不正確的貯存

          酶標板貯存于2-8℃;使用結合力低點的Elisa板

          8

          沒有正確封閉

          在標準品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間

          9

          樣本溶血嚴重

          建議使用非溶血或輕微溶血樣本,嚴重溶血樣本會導致背景偏高。

          重復性不佳,高CV值

          1

          樣品不均一

          加樣前充分混勻樣品,取樣確保移液位置一致;

          2

          包被板表面遭到破壞

          洗板加樣時盡量小心,避免破壞板的包被表面

          3

          孔與孔之間的交叉污染

          孵育后取下蓋子小心操作,避免孔與孔的污染;封板膜不能重復使用

          4

          加樣量不一致

          樣品稀釋前應充分混勻,盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

          5

          邊緣效應(外周孔顯色較中心孔深)

          孵育時盡量100 rpm旋轉混勻

          6

          微量加樣不準確

          保證微量加樣的準確性和均一性

          7

          不正確的洗滌

          洗液準確配制;充分洗滌,靜置15秒,確定每一步的洗滌

          出現白板,陽性對照不顯色

          1

          顯色液變質

          更換新的顯色液

          2

          洗滌液配制有誤

          請按說明書所示稀釋倍數配制

          3

          未加酶結合物而認為已加入

          注意不要漏加

          4

          終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用

          每次加液前均應看清標簽

          5

          標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題

          請按照說明書所示配置說明書,注意單位和稀釋倍數

          6

          不同試劑盒或不同批號的試劑混用

          建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

          不正常的標準曲線

          1

          錯誤的方法重懸標準品

          加入正確量的溶液重懸標準品,重懸充分

          2

          標準品稀釋錯誤

          按照說明書要求稀釋標準品

          3

          標準品污染

          使用一次性的滅菌吸頭,標準品貯存于2-8℃

          4

          錯誤的倍比稀釋步驟

          按照說明書倍比稀釋標準品

          5

          波長選擇錯誤

          TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長為450nm,后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。

          6

          標準品混用

          不同批號試劑勿混用

          7

          試劑盒在運輸途中時間太長,溫度太高,標準品失活

          盡量縮短運輸時間,夏季應放冰塊降溫

          8

          ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm

          TMB顯色需終止后檢測,否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。(數值仍有梯度規律)

          樣品或標準品OD超出正常范圍

          1

          錯誤的樣品或標準品的稀釋

          完全按照說明書稀釋

          2

          偶聯抗體濃度過高

          按照說明書調整到最佳的濃度

          3

          TMB底物孵育時間過長

          調整到合適的孵育時間

          4

          樣品或標準品污染

          避免污染

          5

          錯誤的孵育時間或溫度

          完全按照說明書

          6

          孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染

          貼封片或加蓋

          標曲很好,但是樣本無法計算到數值

          1

          標曲選擇不合適

          選擇最合適的標曲擬合;

          2

          樣本含量很低,低于靈敏度無法被檢測到

          嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測

          3

          樣本含量很高,超過標曲

          建議進行預實驗摸索稀釋倍數,確保樣本OD值落在標曲范圍內

          標曲高濃度間無明顯趨勢

          1

          如OD絕對值靠譜,但是僅無梯度,則顯色過度

          TMB顯色體系中建議根據S1,S2顏色進行判斷,當S1,S2深藍色,有明顯梯度,S5有淡藍色時即可終止。

          2

          僅作單波長檢測。

          由于參考波長讀取非特異性檢測,如指紋、劃痕、水漬等,對結果也有影響。建議最終結果以雙波長為最準確。

          點擊進入黃石研科生物科技有限公司展臺查看更多 來源:教育裝備采購網 作者:黃石研科生物科技有限公司 責任編輯:趙國成 我要投稿
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