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問題 |
序號 |
可能原因 |
解決方法 |
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顯色淡，靈敏度偏低 |
1 |
試劑盒未充分平衡 |
試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃） |
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2 |
樣品不適合做ELISA檢測 |
樣品一般選擇培養上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件（例如稀釋液的成分） |
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3 |
酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥 |
防止板過于干燥 |
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4 |
包被抗體遭到破壞 |
操作溫和，移液槍不能碰到孔底 |
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5 |
樣本和抗體孵育條件不合適 |
按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。 |
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6 |
洗滌浸泡時間過長 |
按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間； |
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7 |
偶聯HRP試劑污染 |
棄去試劑，重新配置 |
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8 |
錯誤的稀釋偶聯HRP試劑 |
棄去試劑，重新配置 |
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9 |
TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間 |
確定合適的孵育時間：人為判定-最高濃度的標準品出現深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65 |
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10 |
樣本濃度過高或存在基質效應 |
建議做不同稀釋倍數，確認樣本最佳稀釋倍數。 |
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11 |
酶標儀濾光片設置有問題或者波長選擇不對 |
確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。 |
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12 |
酶標板不適合做ELISA |
不能使用細胞培養板，建議使用ELISA專用高吸附力板子。 |
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背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） |
1 |
洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留 |
洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。 |
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2 |
底物污染，未避光保存，出現顏色 |
棄去底物，重新配置 |
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3 |
樣品稀釋液污染 |
棄去稀釋液，重新配置 |
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4 |
吸頭重復使用，未洗凈或消毒不徹底 |
吸頭盡可能一次性使用 |
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5 |
不正確的孵育時間，溫度（尤其是底物孵育的時間） |
最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說明書要求。 |
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6 |
偶聯抗體（streptavidin-HRP）濃度過高 |
按照說明書調整到最佳的濃度 |
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7 |
ELISA板子不正確的貯存 |
酶標板貯存于2-8℃；使用結合力低點的Elisa板 |
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8 |
沒有正確封閉 |
在標準品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間 |
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9 |
樣本溶血嚴重 |
建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴重溶血樣本會導致背景偏高。 |
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重復性不佳，高CV值 |
1 |
樣品不均一 |
加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致； |
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2 |
包被板表面遭到破壞 |
洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面 |
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3 |
孔與孔之間的交叉污染 |
孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復使用 |
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4 |
加樣量不一致 |
樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴 |
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5 |
邊緣效應（外周孔顯色較中心孔深） |
孵育時盡量100 rpm旋轉混勻 |
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6 |
微量加樣不準確 |
保證微量加樣的準確性和均一性 |
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7 |
不正確的洗滌 |
洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌 |
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出現白板，陽性對照不顯色 |
1 |
顯色液變質 |
更換新的顯色液 |
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2 |
洗滌液配制有誤 |
請按說明書所示稀釋倍數配制 |
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3 |
未加酶結合物而認為已加入 |
注意不要漏加 |
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4 |
終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用 |
每次加液前均應看清標簽 |
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5 |
標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題 |
請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數 |
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6 |
不同試劑盒或不同批號的試劑混用 |
建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 |
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不正常的標準曲線 |
1 |
錯誤的方法重懸標準品 |
加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分 |
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2 |
標準品稀釋錯誤 |
按照說明書要求稀釋標準品 |
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3 |
標準品污染 |
使用一次性的滅菌吸頭，標準品貯存于2-8℃ |
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4 |
錯誤的倍比稀釋步驟 |
按照說明書倍比稀釋標準品 |
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5 |
波長選擇錯誤 |
TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。 |
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6 |
標準品混用 |
不同批號試劑勿混用 |
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7 |
試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活 |
盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫 |
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8 |
ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm |
TMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。（數值仍有梯度規律） |
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樣品或標準品OD超出正常范圍 |
1 |
錯誤的樣品或標準品的稀釋 |
完全按照說明書稀釋 |
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2 |
偶聯抗體濃度過高 |
按照說明書調整到最佳的濃度 |
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3 |
TMB底物孵育時間過長 |
調整到合適的孵育時間 |
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4 |
樣品或標準品污染 |
避免污染 |
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5 |
錯誤的孵育時間或溫度 |
完全按照說明書 |
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6 |
孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染 |
貼封片或加蓋 |
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標曲很好，但是樣本無法計算到數值 |
1 |
標曲選擇不合適 |
選擇最合適的標曲擬合； |
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2 |
樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到 |
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3 |
樣本含量很高，超過標曲 |
建議進行預實驗摸索稀釋倍數，確保樣本OD值落在標曲范圍內 |
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標曲高濃度間無明顯趨勢 |
1 |
如OD絕對值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度 |
TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷，當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。 |
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2 |
僅作單波長檢測。 |
由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，對結果也有影響。建議最終結果以雙波長為最準確。 |
