體外暴露染毒技術改進后實驗重復性的提高

　　1.簡介：

　　目前的體外暴露染毒研究中，受試化合物可在氣液界面直接與細胞接觸(Cultex)，避免了傳統浸沒培養暴露中培養基成分對實驗的干擾。在此氣-液界面體外暴露染毒過程中的實驗重復性(穩定性和再現性)取決于細胞體外暴露染毒技術及暴露系統的優化設計。

　　在文獻中，我們常見到的受試物在氣液界面直接與細胞暴露接觸的體外暴露染毒方案有不同類型(Aufderheide，2005;Aufderheide et al.，2005)。在這里，我們把兩個主要應用的模塊類型，即線性流體外暴露染毒系統(Linear Flow System)和輻射流體外暴露染毒系統(Radial Flow System)進行實驗測試對比，以討論這兩種方法的差異。

　　2. 材料與方法

　　2.1 體外暴露染毒系統

　　2.1.1 CULTEX CG(線性流暴露染毒系統Linear Flow System) 第一代氣液界面體外暴露染毒系統 見圖1，主要特點是細胞培養小室及進氣氣溶膠入口線性分布，上下兩個模塊形成緊密的封閉系統。底部模塊為細胞培養部分，具備37℃水浴及可流動的培養基供給;頂部是與培養小室對應分布的線性的氣體進出模塊，通過在后端連接的抽氣泵，在密閉腔室內實現負壓，所需暴露物質不停進入密閉系統內完成暴露染毒后才從后端排出。細胞培養小室中形成良好的細胞培養環境，其中的細胞并可與頂部進來的氣體進行直接接觸，實現直接的氣液界面暴露。該系統適用12 mm細胞培養小室。

　　2.1.2 CULTEX RFS(輻射流暴露染毒系統Radial Flow System) 第二代暴露氣液界面體外暴露染毒系統(http://www.bio-launching.com/s02/product/2012/10/24/16298667.html) 見圖2，圖3，是一套全新設計的體外暴露染毒系統模塊。采用新型的輻射性管理氣路設計：底部模塊中的細胞培養(三個或六個)小室呈對稱輻射分布、頂部模塊的進氣口直接分成輻射對照分布的三個(或六個)進氣通道，密閉后頂部進入氣體直接與底部小室內對應的細胞進行接觸暴露。同時系統提供可持續流動的培養基以及360度分布的水浴，保證體外細胞培養環境。

　　2.1.3 CULTEX DG顆粒物氣溶膠發生器( Wright 1950 )，全自動干粉狀顆粒物氣溶膠發生器，進料速度 800 U/min, 氣流大小 8 L/min，暴露的時間和顆粒類型見附表1。

　　表格1 實驗物質的主要參數

　　2.1.4 全自動香煙煙霧發生器，K3R4F 研究性香煙(University of Kentucky, Lexington, KY, USA)，吸煙參數設置35 mL puff volume/2 s, 1 puff per minute, 7 puffs per cigarette，通氣流量1L/min。

　　2.1.5 顆粒物沉積，顆粒物沉積如圖5所示，在細胞小室內沉積的顆粒物均在玻璃纖維膜上(Type: MNGF-1; Machery-Nagel, Germany)，玻璃纖維膜通過Clip Fit(圖4)裝置固定在細胞培養小室內，實驗稱重分析天平(SE2F Microbalance, readability: 0.1 mg; Sartorius GmbH, Germany)。

　　3. 結果

　　不同粒徑及質量的顆粒物在兩種不同暴露染毒模塊內有不同的沉積結果。通常情況下，雖然粒子的理化性質及粒徑大小可能會對顆粒沉積有影響，但在同一粒子的暴露結果可以看出，輻射流暴露染毒系統CULTEX RFS中三個位置暴露數據的具有更低的偏差和相對標準偏差，且相對標準偏差都在5%以內。線性流暴露染毒系統CULTEX CG的相對標準偏差全部大于10%，其精密度及三通道間的實驗平行性及重復性均較差。

　　表格2 Pural 200暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質量及分析

　　3.1 高純氧化鋁Pural 200

　　3.1.1高純氧化鋁Pural 200的粒徑范圍為40納米～40微米。線性流暴露染毒系統和輻射流暴露染毒系統采用同一個氣溶膠發生器進行發生。相同暴露時間后，暴露前后分別對玻璃纖維膜進行稱重，獲得膜上沉積顆粒重量見附表2。

　　3.1.2兩個暴露模塊實驗數據表明，平均而言，在顆粒物沉積的質量上，線性流暴露染毒系統超過輻射流暴露染毒系統。但在同一時間，輻射流暴露染毒系統的三暴露染毒位置獲得的數值變化幅度顯著減小。這意味著，輻射流暴露染毒系統三個腔室能夠更加平等的分布顆粒，通道間的平行性更好，實驗重復性和穩定性更佳。為了研究這方面，我們進一步研究其他兩種顆?；衔镅趸~微米顆粒和氧化銅納米顆粒。

　　3.2 氧化銅微米顆粒

　　氧化銅顆粒粒徑<5mm，實驗數據如表3所示，我們觀察到1、輻射流暴露染毒系統中的沉積數據具有非常高的重復性，而線性流暴露系統沉積的數據偏差相當大;2、顆粒在玻璃纖維膜上沉積的分布差異非常大如圖6，線性流暴露系統中顆粒主要集中分布在膜中央，而輻射流暴露系統中顆粒非常均勻的分布在整張膜表面上。

　　表格3 氧化銅微米顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質量及分析

　　表格4 氧化銅納米顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質量及分析

　　3.3 氧化銅納米顆粒

　　氧化銅顆粒粒徑<42nm，實驗數據如表4所示，觀察到與氧化銅微米顆粒實驗類似的效果，線性流暴露系統沉積的數據偏差比輻射流暴露系統高很多，而玻璃纖維膜上顆粒的沉積分布輻射流暴露系統則更加均勻一致如圖7。

　　表格5 K3R4F煙氣顆粒暴露30分鐘后在玻璃纖維膜上沉積質量及分析

　　3.4 主流煙(K3R4F research cigarettes)

　　香煙煙霧的對比實驗進一步證實了前面實驗所取得的結果，數據見表5。如表5數據所示，我們可分析認為線性流暴露系統中顆粒沉積具有非常大的不穩定性，數據偏離較高，輻射流暴露系統具有非常穩定而可重復的顆粒沉積效應。

　　4. 討論

　　在受試物為氣體時，細胞培養小室和氣溶膠入口是否為線性排列，并不重要，因為，氣體的分布是均勻的。但當受試物為顆粒物氣溶膠時，由于其具有復雜顆粒物粒徑大小分布及物理化學性質，其線性方向運輸將對其顆粒物的沉積產生非常大的影響。(1)顆粒物濃度及粒徑分布在稀釋系統中的穩定性收到影響;(2)在不同的細胞小室上沉積的粒子濃度及粒徑將發生變化，導致在不同的細胞小室內沉積顆粒的平行性和重復性較差。顯然，壓縮空氣的進氣稀釋是無法打破受試物質的層流分布，這將無法改變如上所述沉積效應的產生。

　　考慮到這些缺點，細胞培養小室和氣溶膠入口分布需要進行根本性的改變。為了避免受試顆粒物暴露的不均勻性，Cultex推出的全新概念的二代暴露染毒模塊Cultex RFS。在這里，氣溶膠將通過一個帶有噴嘴(Mohr, 2013)的中央入口統一進入，在噴嘴處氣溶膠將均勻分散到三個中央輻射分布的通道內，通過該通道進入輻射分布的細胞培養室內，如此過程后，氣溶膠在三個細胞小室內沉積的均一性和重復將大大提高。該實驗中不同顆粒沉積后的圖片和數據結果都顯示了非常好的效果，三個細胞小室間顆粒沉積偏差和標準偏差都非常理想。與第一代線性流系統比較，我們發現二代輻射流暴露染毒模塊損失了部分顆粒，即每個細胞小室內沉積顆?？傎|量在減少。這是由于Cultex RFS模塊中我們增加了大顆粒物(凝聚粒子)預分離技術，降低了大的或凝聚在一起的顆粒沉積到細胞表面的可能，即提高了顆粒物粒徑分布的均一性，使實驗受試物更穩定。既減小了粗顆粒對實驗的影響，又進一步提高了實驗重復性和穩定性。

　　總之，體外暴露染毒系統結構的設計優化，對體外暴露染毒實驗重復性的提高起到決定性作用，在體外暴露染毒技術上具有劃時代的意義。