分光光度法Spectrophotometry
基本原理
光線是高速運動的光子流，也是具有波長和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率成正比，與波長成反比。肉眼可見的光線稱為可見光?？梢姽庵徽茧姶挪ㄗV的很窄部分(400nm 到760nm)。不同波長的可見光具有不同的顏色。波長大于760nm 的光線稱為紅外線。波長小于400nm的光線稱為紫外線。
當一束白光通過一杯有顏色的溶液時，具有一定波長的光線，選擇性的被溶液所吸收。不同物質由于其分子結構不同，對不同波長光線的吸收能力不同，因此每種物質都具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質。例如核黃素之所以呈現黃色，是由于它僅吸收可見光中的藍光范圍，并測得其吸收峰在450nm(圖2-1)。在紫外光范圍它還有兩個吸收峰。它們分別是260nm和370nm。
分光光度法常被用來測定溶液中存在的光吸收物質的濃度。其理論依據是郎伯—比爾(Lambert-Beer)定律。
(一)郎伯定律(Lambert’s Law)
一束單色光在通過一溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱。若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強度的減弱也愈顯著(圖2-2)
若 I0表示入射光強度，I表示光線通過溶液后的強度，L 表示溶液的厚度。
(二)比爾定律(Beer’s Law)
當一束單色光通過一溶液時，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線強度減弱也愈顯著，與上定律相似。兩者的關系可以表示如下：
其中，C表示溶液的濃度。K2是一常數，受光線波長、溶液性質和溶液厚度的影響。上述公式所表示的光強度與溶液濃度的關系稱為比爾定律。雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有些物質在不同濃度條件下其顏色可能發生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長發生改變。常見的原因如下：
1.有些有色物質在溶液中可能解離成相應的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，造成對比爾定律的誤差。
2.有些物質在較高濃度狀態下可形成絡合物，絡合物使吸收光譜發生改變。例如：氯化鈷在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍色。
3.氫離子濃度和電解質也可引起一些有色物質顏色的改變，這些改變也可能造成比爾定律的誤差。
(三)郎伯——比爾定律及其應用
一般將通過溶液后的光線強度(I)和入射光(Io)的比值稱為透光度(transmittance,T)，將-Log 用吸光度(absorbance, A)表示，以反映該溶液對光吸收的情況。有時也用吸光度(Optical density, O.D.)表示。則它們之間的關系如下
其中，E為消光系數(Extinction coefficient), 表示物質對光線吸收的本領，其值因物質種類和光線波長而異。
從公式(1)可知對于相同物質和相同波長的單色光(消光系數不變)來說，溶液的吸光度和溶液的濃度呈正比。
如果C2為標準溶液的濃度，則可根據測得的吸光度值，按公式(2)求得待測溶液的濃度。
實際工作中為簡便起見，常常不是每測一個待測樣品都做一個標準管，而是事先測定一系列不同濃度的標準管，然后以吸光度對標準濃度作圖，得到標準曲線，測得待測物質的吸光度后，便可從標準曲線上查到相應的濃度數值。
從公式(1)可知，若知道某待測物質的消光系數和溶液的厚度，也可以從吸光度推算出待測溶液的濃度。消光系數的常用表示方法有二：
1.百分消光系數(E1%1cm);濃度以百分濃度來表示的消光系數。百分消光系數等于濃度為1%，液層厚度為1cm 的吸光度值。
2.克分子消光系數(ε);濃度以摩爾濃度來表示的消光系數?？朔肿酉庀禂档扔谌芤簼舛葹?個摩爾濃度，液層厚度為1cm的吸光度值。
用消光系數計算濃度的公式是：
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