TFAR19(PDCD5)是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素(FITC)標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。
進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
(一)TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20)，胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。上海創賽科技提供多聚甲醛，30525-89-4，Paraformaldehyde ,T,88.0%,商品編號：C12-P0018-25G，價格109.25元。
儀器：
低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
方法：
1 懸浮細胞的染色：
(1)收獲正常和誘導凋亡的細胞(0.5~1′106)，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(2)3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(3)加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。上海創賽科技提供PBS-Tween20洗液，BR ,商品編號：D16-1028505-500ml，詢價。
(4)加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。上海創賽科技提供標準胎牛血清，Standard Fetal Bovine Serum ,商品編號：B11-S9030-200ml，價格360元。
(5)加入5ml FITC標記的TFAR19單抗(終濃度為1：40)，4°C反應30min
(6)熒光細胞洗液洗2次，1000rpm 10min。
結果觀察：
將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。
2：貼壁細胞的原位染色：
(1) 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中(內有潔凈蓋玻片)，讓其爬片生長，待長到 50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
(2) 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
(3) 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油(5ml)的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微 鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細胞的培養、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
(二)TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer 上海創賽科技提供緩沖液pH8.7(6mol/L的鹽酸胍),Buffer Solution(Guanidine Hydrochloride) ,商品編號：C12-B2904-100ML，價格598元。
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA(用洗滌液配制)
4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g 檸檬酸 0.51g DDW 100ml
6. 顯色液(現配現用)：底物Buffer 10ml OPD 2mg 30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader(OD490nm)，洗板機
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜(一般24h以上)。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C 過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清(3個重復孔)100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
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