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        1. 教育裝備采購網
          第八屆圖書館論壇 校體購2

          DNA片斷化檢測

          教育裝備采購網 2016-09-23 11:06 圍觀289次

            細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后,采用常規方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

            1. 大分子染色體DNA片段的測定

            細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時,即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,DNA像通過彎管一樣,以其一端指向電場一極而通過凝膠,這種遷移模式稱之為"爬行"。因此,細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后,大的DNA分子便滯流在爬行管中,直至新的電場軸向重新定向后,才能繼續向前移動。DNA分子量越大,這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,DNA就可以按其分子量大小分開。

            2.DNA Ladder 測定

            方法:

           ?、偈斋@細胞(1X107)沉淀;

           ?、诩毎呀庖海?3000rpm′5min, 收集上清;

           ?、?%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C, 2h;

           ?、艿鞍酌窴(2.5mg/ml)37°C,2h;上海創賽科技提供39450-01-6,蛋白酶K,Proteinase K,用于分子生物學,≥30 units/mg protein ,商品編號:C16-P10706-25mg,價格165元。

           ?、?/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,4°C過夜?14000rpm′15min;上海創賽科技提供4418-26-2,脫氫醋酸鈉,99% ,商品編號:D16-1019891-100g,價格155元。

           ?、拮詈髮⒊恋砣芙庠赥E buffer中,加DNA Loading Buffer;

           ?、?.2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色并照相。

            3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析

            方法:

           ?、偈占毎?,70%冷乙醇(in PBS)4°C固定過夜,PBS洗滌;上海創賽科技提供重組人 RNase A,Ribonuclease A,RNASE1 蛋白 (His 標簽),Ribonuclease, RNase A family, 1 (pancreatic) Protein,商品編號:C86-134-68-50ug,價格2210元。

           ?、?000rpm′10min RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min PI(50mg/ml)染色,室溫避光15min;上海創賽科技提供957054-30-7,GDC-0941GDC0941>98%,有效的PI3Kα/δ抑制劑 ,商品編號:C84-4843-10mg,價格931元。

           ?、跢ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

            4. ApoAlertTM LM-pcr Ladder Assay (CLONTECH)

            優點:敏感度高,適合于檢測少量樣本,小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

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