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          胚胎植入前染色體篩查的新技術

          教育裝備采購網 2016-04-15 08:24 圍觀1450次
          盡管體外受精(IVF)已經徹底改變了不孕不育的治療,但這個過程本身不夠高效,成功率很低。染色體非整倍體,是造成體外受精失敗的主要原因,因為大多數非整倍體胚胎無法植入,或在孕早期流產。因此,提高成功率的關鍵,是選擇染色體數目正常的胚胎。為此,人們開始采用胚胎植入前染色體篩查(PGS)。

          他們最早使用的分子細胞遺傳學技術是熒光原位雜交(FISH)。不過,一些報道認為,基于FISH的PGS結果是站不住腳的。不少前瞻性隨機臨床試驗發現,在使用FISH進行PGS后,妊娠率并沒有任何改善。這是因為FISH只能篩查有限的染色體。于是,人們將目光轉移到能篩查全部24條染色體的新技術,以便對胚胎進行更準確的評估。

          如今,一系列分子遺傳學技術被開發出,能夠對單個或少量細胞中的24條染色體進行分析,如比較基因組雜交芯片(aCGH)、單核苷酸多態性芯片(SNP)和定量PCR反應(qPCR)。

          Array CGH是第一個在全世界廣泛使用的染色體全面篩查技術。它包含了與整個或部分基因組雜交的探針,通過比較每個探針的雜交強度,專家可確定特定區域是否缺失或擴增。這實現了拷貝數變異(CNV)和雜合性缺失(AOH)的檢測。

          新一代測序(NGS)技術則有望帶來更多的突變數據。假如測序深度足夠,從理論上能夠以核苷酸的分辨率定位結構和拷貝數變異。相比之下,芯片的分辨率大抵在kb數量級。隨著分辨率的提高,NGS可檢測染色體倒位以及與疾病相關的點突變。

          下面,我們就來看看胚胎植入前染色體篩查中常用的產品。

          芯片

          24sure芯片是許多參考實驗室及IVF實驗室的選擇,由英國BlueGnome公司開發。2012年,這家公司被Illumina收購。到目前為止,24sure芯片已經處理了超過35萬個臨床樣本。

          24sure芯片利用先進的芯片技術和前沿的BlueFuse分析軟件,全面并準確地評估胚胎活檢中的全部24條染色體。這些芯片可用于第一和第二極體、卵裂球活檢和滋養外胚層活檢中的非整倍體篩查。分析結果的可信度高,有助于選擇整倍體胚胎進行植入。篩查可以在12小時內完成,因此不會干擾新一輪IVF的時間進度。

          它的具體過程包括:(1) 擴增。從新鮮或冷凍的單細胞中提取出DNA并擴增。在QC之后,經過擴增的模板可立即使用,或保存待用。(2) 標記。利用隨機引物和Cy染料標記擴增后的模板。(3) 雜交。將標記后的片段與24sure芯片雜交。洗掉未結合的DNA。(4) 掃描。利用激光掃描儀掃描芯片,生成此芯片的.tiff圖像文件。(5) 數據分析。利用BlueFuse Multi分析軟件存儲、分析并解釋數據。分析是全自動的,且結果很容易解釋。

          關于胚胎植入前染色體分析的首個公開發表的隨機前瞻性研究表明,在IVF治療階段使用24sure技術選擇性植入整倍體胚胎,可明顯提高懷孕率1。Yang Z等人報告稱,在預后良好的患者組,20周時的妊娠率提高了65%。利用24sure芯片選擇整倍體胚胎(n=55),妊娠率達到69.1%,而在標準的胚胎形態選擇(n=48)后,妊娠率僅為41.7%。這項研究的結果提供了直接的證據,說明即使是預后良好的年輕女性,24sure分析也可以提高妊娠率。

          安捷倫的SurePrint G3 human CGH 8?×?60 K oligo芯片也廣泛用于染色體的全面篩查。此外,這家公司最近還推出了GenetiSure Pre-Screen Kit,可篩查第三天和第五天胚胎的單細胞中的非整倍體以及其他5-10 Mb范圍內的基因組畸變。它將整個運行周期縮短至8小時以內,可同時分析多達14個樣本和2個參考樣本,在不明顯增加成本的前提下篩查更多胚胎。

          測序

          Illumina在2014年也推出了基于NGS的篩查方案。VeriSeq PGS方案,由VeriSeq PGS Kit 和MiSeq測序系統組成,利用新一代測序(NGS)技術來全面、準確地篩查全部24條染色體,以選擇整倍體胚胎。VeriSeq PGS所產生的PGS結果與廣泛使用的24sure芯片型技術相當。此外,NGS具有改善分析流程、提高通量和增強性能的潛在機會。生物通 www.ebiotrade.com 

          VeriSeq PGS方案提供了一種快速、整套的PGS流程,可以在大約12小時內完成。首先,利用SurePlex DNA Amplification Kit從單個胚胎細胞中提取DNA并擴增。之后利用VeriSeq DNA Library Kit對擴增后的樣品進行簡化的文庫制備。最后,將制備好的文庫上樣到流動槽中,并在MiSeq系統上測序。

          在最近的一項研究中,Fiorentino等人驗證了NGS在PGS中的使用2。在雙盲研究中,他們評估了18個單細胞和單個卵裂球的190個全基因組擴增產物,評估了4,992條染色體,其中402條拷貝數具有非整倍型。NGS在非整倍體檢出上的特異性為99.98%,而靈敏度為100%?;贜GS的24條染色體非整倍體篩查操作的陽性預測值和陰性預測值都為100%。

          在Zheng等人去年發表的文章中,他們比較了NGS和aCGH方法3。他們認為,基于NGS的拷貝數分析可能是最準確,最具信息量的,因為這種方法使用數千個位點的序列數據。與aCGH相比,NGS也不需要對照樣本,動態范圍也更大。不過,NGS同樣有限制,不建議用來檢測低水平鑲嵌。它也不能直接檢測平衡染色體重排。

          當然,成本也是人們考慮的因素。目前,每個樣本的NGS檢測成本比aCGH高10-20美元。作者認為,這可能是因為這種技術剛剛開始用于人類的胚胎植入前染色體篩查。隨著NGS成本的大幅下降,人們相信NGS的成本有望低于aCGH。

          未來,我們還需要更多的數據,來證明這些新技術確實能提高體外受精的成功率。

          了解Illumina應用于PGS的更多產品

          參考文獻

          1. Yang Z. et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 2012 May 2;5(1):24
          2. Fiorentino F. et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertil Steril. 2014 May;101(5):1375-82.

          3. Zheng H. et al. Application of next-generation sequencing for 24-chromosome aneuploidy screening of human preimplantation embryos. Molecular Cytogenetics 2015 8:38

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