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          上海嘉鵬對聚合酶鏈式反應技術概述

          教育裝備采購網 2016-04-14 14:33 圍觀1397次

            聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術是基因擴增技術的一次重大革新,是分子生物學發展史中的一個重要里程碑。使用PCR擴增技術,可以將極微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬倍,大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術具有敏感度高、特異性強、快速簡便等優點,在醫學、遺傳學、法醫學、微生物學、食品檢驗、衛生檢驗等眾多領域中具有巨大的應用價值和廣闊的發展前景。

            耐熱DNA聚合酶的應用是PCR技術的核心。根據是否具有3’→5’端外切酶活性,耐熱DNA聚合酶通常分為無校讀活性和有校讀活性兩類。無校讀活性的DNA聚合酶(以Taq 酶為代表)具有較高的擴增效率,但由于缺乏校讀活性,容易發生堿基錯配,故產物中點突變較多。Taq DNA聚合酶還具有末端轉移酶活性,可在PCR產物的3’末端非特異地添加堿基,因單個A突出堿基的比例最高,故PCR產物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接(即TA克隆),方便PCR產物的克隆、擴增和測序。然而,TaqDNA聚合酶在PCR反應第一步升溫過程中即可催化錯配引物延伸或引物二聚體形成,因而導致非特異性擴增,影響目的片段的合成量。針對這一現象設計的熱啟動Taq DNA聚合酶,在低溫時其聚合酶活性被抑制,通過高溫變性,聚合酶的活性恢復,催化特異性結合的引物擴增,因而提高了目的片段的特異性和產量。另一類有校讀活性的DNA聚合酶(以Pfu為代表)可選擇性地去除錯誤摻入的dNTP,維持DNA鏈的正確延伸;然而其擴增效率通常低于Taq DNA聚合酶,特別是對于長片段DNA鏈的延伸能力較差?;谏鲜鰞深惷傅奶攸c,可將適量的Taq DNA聚合酶與任意一種有校讀活性的DNA聚合酶混合,在適當的反應緩沖液體系中,可獲得保真性與擴增性能介于上述兩類酶之間的混合酶,用于長片段以及復雜模板的高保真擴增。

            PCR實驗受諸多因素的影響。優質的商業化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通??梢詽M足絕大多數DNA片段擴增的需要。首先應根據模板的性質(基因組、cDNA、質粒等)和目的片段的大小、GC含量、有無二級結構等,選擇合適的DNA聚合酶(參見GenStar® PCR產品選擇指南)。對于難于擴增的片段,應針對不同的模板、引物,優化反應條件,以獲得最佳的擴增效率(詳見“常規PCR反應的優化方法)。

            A. 模板用量:以50 μl反應體系為例

            ? 人基因組DNA:0.1~1.0 μg

            ? 大腸桿菌基因組DNA:10~100 ng

            ? λ DNA:0.5~5 ng

            ? 質粒DNA:0.1~10 ng

            B. 引物設計原則:

            ? 引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個堿基之間;擴增長片段時最好在24~30個堿基之間;

            ? (G+C)%含量應盡量控制在40~60%,兩條引物的(G+C)%含量應盡量接近;

            ? 盡量避免相同堿基連續出現三次以上,3’端應避免使用A或T;

            ? 避免引物內部自身配對形成二級結構;

            ? 正反向引物之間應避免配對堿基,尤其是3’端的三個堿基,否則易生成引物二聚體(Primer dimer);

            ? 兩條引物的Tm值應盡量接近,最好相差不超過5oC;

            ? 引物Tm值的計算方法:

            20 nt以下:Tm = 2x(A + T)+ 4x(G+C)

            20 nt以上:Tm = 81.5+0.41x(G+C%)-600/nt(nt:引物的堿基數)

            C. 引物用量:

            ? 0.1~1.0 μM,通??梢?.2 μM起始,根據體系不同調整用量;

            ? 使用簡并引物、隨機引物時,需增加引物總量以彌補產量損失;但隨著引物量加大,特異性將降低;

            ? 模板較大較多,或結構較復雜(如人基因組DNA)時,需減少引物用量以提高特異性;

            ? 模板較小較少(如質粒模板)時,增加引物用量可提高產量。

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