植物多參數熒光與葉綠素熒光技術及應用

       Multiplex植物多參數熒光技術是一種新型的手持式植物熒光傳感器技術，用于非破壞性測量植物生理狀態相關的多種參數。Multiplex植物多參數熒光技術使用多種激發光源(UV、藍、綠、紅)來激發各種植物材料的熒光，比如葉片、針葉、作物、草地、果實、蔬菜、谷物等。它可以非破壞地同步測量20項參數(表1，Zhang, 2012)，比如花青素、黃酮和葉綠素的含量，葉綠素熒光激發比和UV(紫外)激發的藍綠熒光(BGF)等。

　　表1. MULTIPLEX測量參數描述(Zhang, 2012)

　　這項技術被廣泛應用于植物逆境生理研究;病蟲害早期預測;施肥管理、蛋白含量預測;蔬菜品質及收獲期判斷;遙感，精準農業;次生代謝物質研究;葡萄酒、茶多酚、蘋果多酚原料選擇;其他水果等香氣物質測量及收獲期判斷;中藥有效成分分析及品種選育;芳香植物有效成分分析及品種選育;觀賞植物如花卉、觀葉植物等優良品種選育等研究和育種中。

　　Multiplex熒光技術可以快速無損地檢測色素和無色的黃酮，而它們可以用來評估蘋果的成熟度和品質。Betemps使用Multiplex熒光儀檢測了三種不同品種的蘋果，富士(Fuji)、澳洲綠蘋果(Granny Smith)和金冠(Golden Delicious)(圖1，Betemps, 2012)。

　　圖1. A. 便攜式Multiplex熒光儀 B. 富士(Fuji) C. 澳洲綠蘋果(Granny Smith) D.金冠(Golden Delicious) 圖2. ANTH、FLAV和CHL與花青素、黃酮和葉綠素實際含量的線性回歸關系(Betemps, 2012)

　　結果發現，所有品種陽面的黃酮指數(FLAV)都要高于陰面。富士陽面的花青素指數(ANTH)要高于陰面。而綠蘋果和金冠陰面的葉綠素指數(CHL)要高于陽面。與破壞性方法萃取蘋果皮測量得到的花青素、黃酮和葉綠素含量相比，ANTH、FLAV和CHL都與其有極好的線性回歸關系(圖2)。而蘋果糖分含量與葉綠素熒光的遠紅光譜帶之間發現了負相關關系。

　　Cerovic則使用MULTIPLEX熒光儀為波爾多一處葡萄園中每一株葡萄描繪了一張花青素和黃酮地圖(圖3，Cerovic，2009)。

　　圖3. Multiplex熒光儀 A)在田間進行測量;B)熒光儀頂視圖;C)光學探頭前視圖，可見LED光源(6個UV和3個RGB)和中間的3個檢測器(YF，FRF，RF)(Cerovic，2009)

　　他們希望通過使用Multiplex技術進行多年的研究，從而描述葡萄品質特性的變化。初步研究中發現花青素和葡萄產量間存在弱相關性。由于土壤特性的差別，造成了每一個小樣地之間都會存在差異(圖4)。

　　圖4. 反映果實特性的Multiplex參數的空間變化圖(Cerovic，2009)

　　葉綠素熒光中包含了可以深入反映植物光合系統電子傳遞鏈狀態的大量信息。因此從上世紀70年代開始，葉綠素熒光技術就逐漸成為一種極為重要的植物生理研究技術。而FluorCam葉綠素熒光成像技術正是這一技術最先進的代表。關于FluorCam葉綠素熒光成像技術的詳細介紹請見《FluorCam葉綠素熒光成像技術及其應用》。

　　由于葉綠素熒光技術可以直接反映植物的受脅迫狀況，因此經常與Multiplex植物多參數熒光技術聯合應用在研究中(Tremblay，2012)。Suthaparan在研究UV-B對黃瓜白粉病影響時，就同時使用了Multiplex熒光儀和葉綠素熒光儀。分別測量不同時間UV-B照射后，花青素、黃酮和葉綠素熒光參數Fv/Fm的差異(表2，Suthaparan，2014)。

　　表2. 黃瓜感染白粉病并照射不同時間UV-B后的花青素、黃酮和葉綠素熒光參數Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　表2. 黃瓜感染白粉病并照射不同時間UV-B后的花青素、黃酮和葉綠素熒光參數Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　FluorCam葉綠素熒光成像技術尤其是其獨有的多光譜熒光成像技術不但可以測量葉綠素熒光參數并成像，而且能夠測量Multiplex中的絕大部分參數并成像，同時還具備許多MULTIPLEX和傳統葉綠素熒光技術不具備的功能。

　　FluorCam系列葉綠素熒光成像系統中可以進行MCF成像分析的系統有FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統，FluorCam開放式多光譜熒光成像系統和FKM多光譜熒光動態顯微成像系統。FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統和FluorCam開放式多光譜熒光成像系統都具備三種激發光：紅色、藍色和紫外光，同時內置7位濾波輪和相應光學濾波器，不僅可以進行一般的葉綠素熒光成像分析，還可進行 UV-MCF 熒光成像分析和GFP熒光蛋白等成像分析。同時，FluorCam開放式多光譜熒光成像系統由于其獨特的模塊式組合，具備多功能、高靈活性和高度擴展性能，還可選配綠色光源、青色光源等各種LED激發光源，對其它熒光蛋白與熒光染料如BFP、CFP、YFP等熒光蛋白進行熒光成像分析研究。

　　圖5. FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統

　　圖6. FluorCam開放式多光譜熒光成像系統

　　FKM多光譜熒光動態顯微成像系統則是目前功能最為強大全面的藻類/植物顯微熒光研究儀器，不僅可以進行微藻、單個細胞、單個葉綠體甚至基粒-基質類囊體片段進行Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、MCF多光譜熒光、OJIP快速熒光響應曲線、QA再氧化等各種熒光成像動力學分析;還能通過激發光源組進行任意熒光激發和熒光釋放波段的光譜分析測量，從而進行藻青蛋白、藻紅蛋白等藻類特有光合色素的成像分析;更可以利用光譜儀對各種激發光和熒光進行光譜分析，區分各發色團(例如，PSI和PSII及各種捕光色素復合體等)以及MCF全光譜圖分析。除對葉綠素熒光動態進行成像光譜分析外，還可對靜態熒光如GFP熒光、DAPI熒光、DiBAC4熒光、SYTOX 綠色熒光、CTC熒光染色等熒光蛋白、熒光素進行成像分析。

　　圖7. FKM多光譜熒光動態顯微成像系統

　　由于FluorCam多光譜熒光成像系統具備紅光、藍光、綠光、UV等多種光源和相應的濾波器，因此使其不但可以測量和計算Multiplex技術中相應的參數，而且可以通過CCD成像反映植物不同部位的細微差異，測量樣品范圍擴展到了整株植物到微藻、單個細胞、單個葉綠體甚至基粒-基質類囊體片段。

　　Pineda使用辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)的兩種不同毒株感染Nicotiana benthamiana。結果發現BGF成像能在檢測到病毒之前就發現病毒引起了葉片變化。而葉綠素熒光則驗證了病毒感染對植物光合系統的影響。熒光比率F440 ? F690 和F440 ? F740在感染后明顯增加(圖8)。Pineda認為這兩項參數是生物脅迫檢測的極佳指標(Pineda，2008)。此研究中測量了F440、F520、F690、F740。其中F440、F520即為將Multiplex中BGF-UV以更高的光譜分辨率分為了綠色和藍色熒光(BGF即為藍/綠熒光的縮寫);F690即為RF-UV;F740即為FRF-UV。如果使用其他藍色、紅色或者綠色光源進行激發，即可測得Multiplex其他熒光參數并據此計算葉綠素指數、黃酮指數和花青素指數等。

　　圖8. 感染 PMMoV 的Nicotiana benthamiana的 F440 ?F520，F440 ?F690，F440 ? F740和F690 ?F740熒光比率圖(Pineda，2008)

　　參考文獻：

　　1.Zhang Y P, et. al, 2012, A first comparison of Multiplex? for the assessment of corn nitrogen status, Journal of Food, Agriculture & Environment, 10 (1): 1008-1016

　　2.Betemps, et. al, 2012, Non‐destructive evaluation of ripening and quality traits in apples using a multiparametric fluorescence sensor, Journal of the Science of Food and Agriculture, 92(9):1855–1864

　　3.Cerovic Z G, et. al, 2009, Mapping winegrape quality attributes using portable fluorescence-based sensors, Frutic, 9:301-310

　　4.Tremblay N, et. al, 2012, Sensing crop nitrogen status with fluorescence indicators. A review, Agron. Sustain. Dev., 32:451–464

　　5.Suthaparan A, et. al, 2014, Suppression of Cucumber Powdery Mildew by Supplemental UV-B Radiation in Greenhouses Can be Augmented or Reduced by Background Radiation Quality, Plant Disease, 98(10):1349-1357

　　6.Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060