鐵死亡是一種鐵依賴性的，區別于細胞凋亡、細胞自噬的細胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 方式，依賴于鐵介導的氧化損傷，鐵積累的增加，自由基的產生，脂肪酸供應與脂質過氧化物增加是誘導鐵死亡的關鍵。
鐵死亡的調控機制
關于鐵死亡的調控，主要受 GSH/GPX4 途徑的調節；鐵代謝以及脂質代謝的相關通路也發揮著重要作用。
關于 GSH/GPX4 途徑
圖 1. GPX4 相關信號通路[1]
System Xc- 是一種廣泛分布在磷脂雙分子層中的重要的抗氧化體系，由兩個亞基 SLC7A11 和 SLC3A2 組成的異二聚體。胱氨酸和谷氨酸通過 Xc-系統 以 1:1 的比例進出細胞交換，被吸收的胱氨酸 (Cystine) 在細胞中被還原為半胱氨酸(Cysteine)，并參與 GSH 的合成。
GPX4 是催化哺乳動物細胞中磷脂氫過氧化物 (PLOOH) 還原的主要酶。GPX4 將谷胱甘肽 (GSH) 轉化為氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并將細胞毒性脂質過氧化物 (PL-OOH) 還原為相應的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可導致脂質過氧化物的積累。GPX4 表達下調的細胞對鐵死亡更敏感，而 GPX4 表達上調則抑制鐵死亡。GSH 在谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX) 的作用下減少 ROS 和活性氮。
此外，甲羥戊酸 (MVA) 途徑通過調節硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟來影響 GPX4 的合成，從而調節鐵死亡的發生。
小貼士：Erastin作為最經典的鐵死亡誘導劑，可抑制胱氨酸輸入，影響 GSH 的合成，導致 GPX 活性降低，細胞抗氧化能力下降，脂質 ROS 積累，最終發生氧化損傷和鐵死亡。
常用的鐵死亡誘導劑RSL3直接作用于 GPX4 并抑制其活性，從而降低細胞的抗氧化能力并積累 ROS，導致鐵死亡。
脂質過氧化與鐵的積累
圖 2. 脂代謝與鐵死亡相關通路[2]
鐵依賴性脂質 ROS 積累與所有途徑的鐵死亡有關。不受限制的脂質過氧化是鐵死亡的標志。
游離多不飽和脂肪酸是合成脂質信號轉導介質的底物，但它們必須被酯化成膜磷脂并被氧化才能傳遞鐵死亡信號。脂氧合酶 (LOX) 和細胞色素 P450 氧化還原酶 (POR) 通過脂質的雙氧合啟動脂質過氧化。研究表明，磷脂酰乙醇胺是誘導細胞鐵死亡的關鍵磷脂。?；o酶 A 合成酶長鏈家族成員 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰膽堿?；D移酶 3 (LPCAT3) 參與磷脂酰乙醇胺的生物合成和重構，激活多不飽和脂肪酸并影響其跨膜特性。因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表達可減少細胞內脂質過氧化物底物的積累，從而抑制鐵死亡。
鐵積累 (如增加鐵吸收、減少鐵儲存和限制鐵外流)可以促進鐵死亡 (具體可見: 鐵死亡是什么，如何檢測？您要的“一文通”來了！)。過量的鐵通過至少兩種機制促進隨后的脂質過氧化：通過鐵依賴性 Fenton 反應產生活性氧 (ROS) 以及激活含鐵酶。
鐵死亡如何檢測呢？
鐵死亡的關鍵指標
鐵死亡是由鐵依賴的脂質過氧化驅動的，因此在鐵死亡期間檢測這種脂質過氧化是必要的。此外，線粒體在鐵死亡期間通常表現出萎縮、致密的形態（因此可以通過檢測線粒體來判斷鐵死亡)。此外，檢測特定的基因表達變化：例如鐵死亡的細胞中 TfR1 的上調及其重定位于質膜。下面小 M 來給大家介紹幾種常用的鐵死亡檢測方式~
最常見的細胞表型檢測
鐵死亡會導致細胞死亡。因此一般在鐵死亡的研究中，檢測細胞活力是常見方法，同時也會通過染色等方法來觀察細胞膜通透性，線粒體形態等。
如在Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制 Frataxin (FXN) 是否會促進鐵死亡。用 Erastin 同時處理 FXN 敲低和對照細胞，12 小時后用 CCK8 法檢測細胞活力，結果表明抑制 FXN 表達顯著增強了 Erastin 誘導的細胞死亡。同時碘化丙啶(PI) 和 CFDA-SE染色結果以及用透射電鏡觀察到的線粒體碎裂、空泡化和嵴增大都表明 FXN 耗竭協同 Erastin 誘導鐵死亡[3]。
圖 3. 抑制 FXN 對 Erastin 誘導的 HT-1080 細胞鐵死亡的影響[3]
A, 細胞暴露于不同濃度的 Erastin，檢測細胞活力；B, Erastin 處理細胞 12 小時后用熒光顯微鏡觀察 PI 陽性細胞；C, Erastin 培養細胞 3 天，用 CFDA-SE (5 μM) 染色，然后進行流式檢測；D, 透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測線粒體的形態變化
亞鐵離子的檢測
細胞鐵積累是鐵死亡的典型標志之一，亞鐵離子積累可以特異性地增加氧化應激水平。例如，在研究氧化應激介導的視網膜色素上皮 (RPE) 變性的潛在機制時，通過用 FerroOrange 染色細胞 (亞鐵離子探針)，結果表明 NaIO3和 Erastin 處理的細胞積累了過多的亞鐵離子，說明誘導了鐵死亡，而 Fer-1或 DFO 預孵育可以抑制亞鐵離子的積累，如圖 4 所示。結果表明鐵死亡是氧化應激介導的 RPE 變性的主要病理過程[5]。
圖 4. 通過 FerroOrange 染色評估亞鐵離子水平[4]
活性氧 (ROS) 檢測
ROS 和脂質 ROS 在鐵死亡中起關鍵作用，文獻報道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制體內的 ROS 水平。細胞內會由于鐵的積累而抑制抗氧化系統，鐵可能直接通過 Fenton 反應產生過量的 ROS，從而增加氧化損傷。因此 ROS 檢測也是常用方法 (活性氧檢測探針:ROS 探針大賽，你要的檢測方法都在這里！)
Lin Li 在研究中發現羧基修飾的聚苯乙烯納米粒子 (CPS) 可以增加細胞內 SOD 水平，因此推測 CPS 可能抑制鐵死亡。實驗結果表明，CPS 抑制了 RAW 264.7 中 Erastin 誘導的 ROS 升高 (圖 5a, b)，并且比去鐵胺具有更強的抗鐵死亡作用 (圖 5c, d)[5]。
圖 5. CPS 有效抑制 RAW 264.7 細胞的鐵死亡[5]
A-B, 在有無 CPS 條件下 Erastin 對 ROS 水平的影響；C-D, 在有無 CPS 或 DFO 條件下Erastin 對細胞活力的影響
脂質過氧化
除了 ROS 檢測，鐵死亡的脂質過氧化的指標還有谷胱甘肽 (GSH) 合成的變化、脂質過氧化物 (MDA, LPO) 水平的變化。
在遺傳性血色素沉著癥 (HH，一種鐵超負荷疾病) 與鐵死亡的關系研究中，為了證實鐵死亡在 HH 相關肝損傷中的作用，作者用鐵死亡抑制劑 Fer-1 治療 Hjv–/–小鼠 (經典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 樣小鼠模型) 三周。如圖 6 所示，與對照組小鼠相比，經 Fer-1 處理的小鼠肝臟 MDA 水平顯著降低，NADPH 水平增加。此外，Fer-1 可以降低小鼠血清 ALT 水平膠原蛋白沉積。結果表明，鐵超載會誘導 HH 小鼠的鐵死亡[6]。
圖 6. 鐵死亡抑制劑 Fer-1 可減輕 HH 小鼠中鐵過載引起的肝損傷[6]
用或不用 Fer-1 治療的野生型、Hjv–/–、Smad4Flox/flox和 Smad4Alb/Alb 小鼠中, A, 肝臟 MDA 含量；B, 肝臟 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝臟 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平
谷胱甘肽代謝
在 DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase一文中，作者探究了 DJ-1 負調節鐵死亡的機制。研究發現，用 RNA 干擾抑制 DJ-1 表達可以與 Erastin 協同抑制細胞內 GSH 水平 (圖 7A)。同時，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆轉 Erastin 誘導的脂質 ROS 積累 (圖 7B) 和細胞死亡 (圖 7C)。因此，作者推測 DJ-1 可能會影響 GSH 的合成從而抑制鐵死亡[7]。
圖 7. DJ-1 通過抑制 GSH 水平負調節鐵死亡[7]
A, Erastin 處理DJ-1 KD H1299 細胞 6 h 后 GSH 水平；
B, 在有無 GSH 或 NAC 條件下細胞用 Erastin 處理細胞 12 h 后脂質 ROS 水平；C, 用Erastin 處理細胞 36 h 后，測定細胞活力
總結：
鐵死亡受細胞內信號通路的嚴密調節，既包括鐵穩態的調節通路,更有鐵代謝以及脂質代謝相關通路等。
但是各個通路相輔相成，互相影響。調控途徑不同， 檢測的指標也十分多樣化，小伙伴們在實驗過程中，檢測方法可要多打 “組合拳”！
相關產品
鐵死亡誘導劑，結合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。
鐵死亡誘導劑，可直接降低 GPX4 的表達。
一種氨基酸，在細胞調節過程中起著重要作用，胱氨酸耗竭會誘導鐵死亡。
選擇性的鐵死亡抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過還原機制來防止膜脂的損傷，從而抑制細胞死亡。
CCK8試劑盒
細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。
可用于細胞增殖，活性毒性的檢測。
可滲透細胞的，用于檢測細胞內活性氧 (ROS) 水平的探針。
用于測量線粒體膜電位的熒光探針試劑盒。
親脂性紅色熒光染料，可用于線粒體膜電位檢測。
收集了 500+ 種文獻報道的具有誘導或抑制鐵死亡相關的化合物及與鐵死亡密切相關的靶點對應的化合物，可以用于鐵死亡機制及相關疾病的研究。
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參考文獻
1. Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.
2. Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296.
3. Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483.
4. Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971.
5. Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465.
6. Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792.
7. Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.
