線粒體狀態呼吸液相氧電極測定方法
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100735
線粒體是細胞物質代謝和能量代謝的樞紐，也是逆境脅迫的主要攻擊位點之一，在生物和非生物逆境脅迫條件下，細胞線粒體正常功能的維持對生物抵抗逆境能力的大小起至關重要的作用。在線粒體呼吸過程中，呼吸電子傳遞伴隨著跨線粒體膜質子梯度的形成，ATP合酶利用這一跨膜質子梯度合成ATP，在正常細胞中，線粒體的電子與質子傳遞是與氧化磷酸化相偶聯的，因此ADP的供應會影響到呼吸電子傳遞的速率。在通常情況下，呼吸電子傳遞的底物如琥珀酸、NADH是充足的，ADP的供應往往作為限制因素，從而調節整個呼吸過程。
為了精確地研究這種基于ADP的呼吸控制，Chance和Williams（1956）根據呼吸底物以及ADP不同存在情況下的線粒體呼吸速率，提出呼吸狀態（又稱狀態呼吸，respiration state）的概念：
A.狀態I呼吸是指在沒有添加任何呼吸底物及ADP情況下線粒體的呼吸速率（內源呼吸）；
B.加入ADP之后的呼吸速率稱為狀態II呼吸；
C.在呼吸底物和ADP都存在時的呼吸速率稱為狀態III呼吸（最大呼吸）；
D.ADP被消耗殆盡但呼吸底物仍然剩余時的呼吸速率稱為狀態IV呼吸（剩余呼吸）。
由于在完整的生物細胞內，線粒體呼吸受到細胞內其它物質代謝以及能量代謝的影響，直接測定細胞的呼吸不能精確地反映線粒體的功能，因此建立一種能夠相對精確測定線粒體內各種狀態呼吸的方法至關重要。
本文列出了改進后的液相氧電極測定小鼠肌肉細胞線粒體的狀態呼吸過程的方法。主要內容有氧氣消耗速率（OCR）、磷氧比（P/O）、呼吸控制率（RCR）和寡霉素敏感呼吸等測定方法。
測定步驟：
1. 配制所需試劑溶液（點擊“閱讀原文”查看詳細信息）
2. 安裝并校準液相氧電極
3. 提取線粒體（點擊“閱讀原文”查看詳細信息）
圖1. 線粒體提取流程
4. 測定過程：線粒體氧氣消耗速率（OCR）及狀態呼吸
4.1 向反應室中加入適量的呼吸緩沖液。
4.2 向反應室中加入適量的線粒體。
4.3 蓋上反應杯蓋。
4.4 點擊“Go”開始測定（此階段為狀態I）。
4.5 在約30s時加入呼吸底物（此階段為狀態IV）。
4.6 在約2min 30s時，使用注射器向反應室中加入ADP（此階段為狀態III）。
圖2. 液相氧電極測定線粒體狀態呼吸流程
4.7 等待所有的ADP消耗，轉換為ATP，此時反應室只有底物，反應速率降低，斜率變緩（此階段為狀態IV）。
4.8 在約4min 30s時加入ADP。
4.9 在約5min 30s時加入寡霉素。
4.10 在約6min 30s時，加入FCCP（可獲得最大呼吸）。
4.11 在約7min 30s時，加入抗霉素A（終止呼吸）。
4.12 在約8min 30s時，停止測定并保存數據。
5. 預期結果
圖3. 健康組織線粒體不同底物狀態呼吸預期曲線
6. 數據獲取和計算
6.1 氧氣消耗速率（OxygenConsumption Rate，OCR）：根據一定時間內線粒體消耗氧氣量計算獲得的。氧電極軟件（OxyTrace+或者O2view）有斜率截取功能。
6.2 呼吸控制率（Respiration Control Index/Rate，RCI or RCR）：計算方式為狀態III/狀態IV（L），該值是耦合線粒體的控制指標。
6.3 磷氧比（P/O，Phosphate/OxygenRatio）：根據狀態III反應前后反應室中的氧氣含量，可以計算出整個狀態III階段的耗氧總量（此時算出的是O2分子數目），最后將測定狀態III時加入ADP的量（分子數目）除以耗氧總量（換算成O原子數目）即得到被測線粒體的P/O。
6.4 寡霉素敏感呼吸（OSR）：將狀態III斜率與注射寡霉素后獲得的斜率進行計算。該值代表H+-ATP合酶活性（注：H+-ATP合酶功能失調可能導致Δψm的改變）。
7. 注意事項
7.1 蓋上反應杯蓋后所有試劑均應使用注射器進行添加。
7.2 需要留出足夠的時間計算加入試劑之后的斜率。上文所示添加試劑的時間并不是固定的，具體時間仍需根據實際情況進行相應調整，建議提前準備預實驗。
7.3 建議同一處理至少進行3次重復以保證其代表性。
7.4 低于初始氧濃度10%時可能出現呼吸限制，影響正常測定。確保在氧氣限制之前完成實驗。
7.5 每次注射后，至少用乙醇和水仔細清潔注射器兩次。
7.6 上文中添加試劑的體積和濃度需根據具體待測對象確定，可參考文末相關文獻
7.7 溫度對氧電極影響較大，實驗必須在恒溫下進行。
7.8 底物和抑制劑易在反復凍融中降解，強烈建議使用新鮮制備的試劑。
8. 問題及解決方法
8.1 如何確保氧電極正常工作？
開始測定，單擊GO。等待信號線穩定。如果信號線穩定，則氧電極工作正常，如果信號線波動較大，氧電極工作不正常。此時需拆卸電極，重新清潔電極，重新安裝校正。
8.2 如何檢查線粒體是否解耦聯？
通過向線粒體體系中添加外源細胞色素c（cyt c）進行呼吸測定。如果線粒體在制備過程中受損或解偶聯，添加cyt c將增加氧通量，表示外膜的損傷和內源cyt c的丟失。
8.3 線粒體未偶聯（低RCR）
可能是緩沖液配制錯誤或儲存不當。建議重新配制所有緩沖液。肥胖和衰老的動物細胞，線粒體質子泄漏增加，線粒體內膜脂質成分改變，RCR會偏低。確保對照組動物年輕健康。
8.4 多次測定后線粒體對底物/抑制劑的反應不正常
可能是氧電極反應室中存在微量抑制劑或雜質（清潔不徹底）。此時需用超純水、乙醇和超純水徹底清潔反應室。也可向反應室內添加PBS+1%BSA，以增強清潔效果。增加洗滌時間也有助于去除抑制劑。
8.5 電極不靈敏（斜率緩慢，信號線不穩定）
檢查反應室中是否存在氣泡。如果有氣泡，可使用吸管反復輕微吸打溶液。檢查鉑極附近是否有氣泡，如果有，需拆卸重新安裝電極?；蛘哌m當增加反應室中線粒體蛋白的濃度。
9. 相關閱讀
9.3 積雪草酸通過線粒體定向防護機制改善大鼠肝臟缺血再灌注損傷
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