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          細菌DNA的提取方法

          教育裝備采購網 2016-08-11 09:37 圍觀795次

            DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法?;瘜W方式如異硫氰酸胍法、堿裂解法。生物方式:酶法。根據核酸分離純化方式的不同有;硅質材料、陰離子交換樹脂等。

            方法(一)

            試劑:

            1. 抽提緩沖液、2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v) (去色素)、100mM Tris-HCl (pH8.0)、25mM EDTA、(pH8.0)、2.0M NaCl。上海創賽提供乙二胺四乙酸(EDTA)標液,60-00-4,商品編號:D16-1014183-濃度:0.1N/L,價格288元。

            2.10M LiCl

            3. 2M LiCl

            4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

            5. 3M NaAc (pH5.2)

            6. 96% 乙醇

            7. 70% 乙醇

            步驟:

            1.抽提緩沖液65℃預熱;

            2. 加菌體到已經預熱的緩沖液(700ul)中混勻,65℃,10min;

            3. 加酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),振蕩,離心12,000rpm,10min;

            4.取上清,加氯仿/異戊醇(24:1)振蕩,離心12,000rpm,10min;

            5. 取上清,重復4步驟;

            6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的異丙醇),-20C沉淀;

            11. 離心12,000rpm,10min;

            12. 棄上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。

            方法(二)

            1. 將菌株接種于液體LB培養基,37℃震蕩培養過夜。

            2. 取1.5ml培養物12000rpm離心2min。

            3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1h。上海創賽提供十二烷基硫酸鈉(SDS),AR,92.5-100.5%,151-21-3,商品編號:C16-S10436-500g,價格50元。

            4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混勻后再65℃溫育10min。

            5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,離心4-5min, 將上清轉入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心。上海創賽提供異丙醇,99.5%,超干,含分子篩,水≤50ppm,67-63-0,商品編號:C52-H11026-100ml,價格150元。

            6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇。

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